全二维气相色谱/飞行时间质谱对微生物降解石油烃产物的分析

刘 虹， 曾繁城，高鹏飞，黄 毅，赵炳岩， 刘子铭

(1.吉林化工学院 资源与环境工程学院，吉林 吉林 132022；2．吉林省中实环保工程开发有限公司，吉林 长春 130031；3.国家地质实验测试中心，北京 100037)

全二维气相色谱(comprehensive two-dimensional gas chromatography，简称GC×GC)是一种能够将复杂混合物分离的新型技术，于20世纪90年代发展起来，该技术能够把分离机理不同又相互独立的两个色谱柱通过调制器采用串联的方式连接成二维气相色谱柱系统，其中，调制器具有捕集、聚焦和再传输的作用.与传统的一维气相色谱技术相比，全二维气相色谱具有分辨率高、峰容量大、灵敏度高以及分析速度快等优势[1].目前，该技术主要被用在石油产品、农药、中药挥发油以及烟气等复杂混合物的分析和研究方面，并且取得了较好的分离效果[2-5].在原油和石油产品研究中，主要用于对其组分的表征[6-8].

石油是一种复杂的混合物，含有多种烃类(包括正烷烃、支链烷烃、芳烃、脂环烃等)、萜类、含氮、氧、硫杂原子烃类物质等[9].其中，大部分石油烃可被微生物代谢、分解.目前，有关微生物降解石油烃、修复环境污染方面的文献较多[10-11].研究微生物降解石油产物，对了解微生物降解石油机理具有重要的意义.冷凯良等采用色谱、质谱、紫外光谱等对微生物降解原油的代谢产物进行了分析，建立了微生物降解原油代谢产物的分析方法，得出微生物降解原油代谢产物主要有乙酸和以棕榈酸为主的脂肪酸与鼠李糖形成的糖酯类表面活性剂[12].花莉等通过采用GC-MS对居植物柔武士菌(Raoultella planticola)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)降解石油烃机制进行了分析，发现不同微生物在降解过程中发挥不同的作用[13].然而，当降解产物中出现不可分辨的复杂混合物UCM(Unresolved Complex Mixtures)时，采用普通的GC不能完全将组分分离并进行详细的分析.因此，本文采用全二维气相色谱/飞行时间质谱(GC×GC/TOFMS)对微生物降解石油烃产物进行分析和研究，探索微生物降解石油污染物的机理.以期为新菌种的筛选及降解性能的评价提供理论依据.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

无机盐液体培养基(单位：mg/L)：(NH4)2SO42000，K2HPO41550，NaH2PO4850，MgCl2·6H2O 100，EDTA 10，FeSO4·7H2O 5.0，ZnSO4·7H2O 2.0，MnCl2·2H2O 1.0，CaCl2·2H2O 1.0，CoCl2·6H2O 0.4，NaMoO4·2H2O 0.2，CuSO4·5H2O 0.2.

原油培养基:无机盐培养基加入柴油.

主要仪器设备:LD4-2A医用离心机、气相色谱仪(Agilent7890B)、手提式压力蒸汽灭菌器、SP-DJ系列垂直净化工作台、HZQ-QX全温振荡器、二维气相色谱仪(Agilent7890)、飞行时间质谱仪(Agilent TOF)等.

1.2 微生物降解石油烃实验

1.2.1 实验菌株

本实验用到的降解石油烃的菌株，是前期研究所得.采集松原油田石油污染土壤，以石油烃作为唯一碳源，筛选所得的高效降解石油烃的菌株，经16S rDNA鉴定，该菌株为微嗜酸寡养单胞菌.

1.2.2 微生物降解石油烃产物的提取

采用前期研究所得的微嗜酸寡养单胞菌作为石油烃降解菌株，进行降解实验.将菌株接入50 mL LB液体培养基中，于120 r/min，30 ℃下振荡培养2 d至对数生长期，将培养液于8 000 r/min离心后，取菌体加入无菌水，制备成菌悬液.取菌悬液5 mL加入100 mL的无机盐培养液、加入400 mg 0#柴油，其中1个样品不加菌液作为空白对照，同时做2组平行样作为对照，加菌培养液OD600约为0.6.以上样品于120 r/min，30 ℃下振荡培养5 d.分别加入20 mL正己烷进行萃取.萃取后的有机相经无水Na2SO4干燥后，分别采用GC，GC×GC系统测试、分析菌株降解石油烃的产物.

1.3 一维气相色谱分析方法

色谱条件：注入口温度280 ℃，载气为氮气，压力59.5 kPa，总流量37.7 mL/min；分流比为20.0；采用 Rtx-1 色谱柱，30.0 m×0.25 μm×0.32 mm，流量为1.65 mL/min，初始温度80 ℃ 下保持3.0 min，然后以8 ℃/min 升温速率升温至100 ℃，再按10 ℃/min 速率升温至200 ℃，按15 ℃/min 速率升温至280 ℃保持15 min，总程序时间共计35.85 min.柱箱的最大温度为330 ℃；检测器温度为290 ℃；进样体积采用1 μL.

1.4 二维气相色谱分析方法

1.4.1 GC×GC仪器和操作条件

GC×GC系统由配有氢火焰离子化检测器(FID)的Agilent7890气相色谱仪和冷喷调制器共同组成.系统使用两套柱系统，具体操作条件详见表1.采用不分流进样方式，进样体积约为1 uL.

表1 GC×GC系统操作条件表

1.4.2 飞行时间质谱

飞行时间质谱仪为美国Agilent公司的TOF.电子轰击电离源的电压为70 Ev，检测器的电压为1 850 kV，传输线的温度为300 ℃，离子源的温度为230 ℃，以每秒100张全谱图的采集频率采集质量数范围在45～700 u的质谱数据.所得数据再经工作站进一步处理.

2 结果与讨论

2.1 一维气相色谱分析

微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃5 d后，所得的培养液见图1.

图1 菌株降解石油烃5 d培养液

由图1可以看出，菌株在以石油烃为唯一碳源的培养液中，大量生长、繁殖，培养液由于菌体的生长，变得非常浑浊.对降解5 d的培养液及未降解前的样品进行提取，采用气相色谱法进行分析，分析结果如图2、3所示.

t/min图2 降解前石油烃气相色谱图

t/min图3 降解5 d后石油烃气相色谱图

图2、3的色谱图进行对比分析，并对所得数据进行计算得出，微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃5 d后，80%以上的石油烃被降解，大部分石油烃组分被完全降解，部分组分降解不彻底.且在降解后的气相色谱图中，出现了不可分辨的复杂混合物UCM，其无法用GC进行分析.因此，进一步采用GC×GC/TOFMS对降解产物进行检测、分析.

2.2 二维气相色谱分析

微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃5 d后的产物经GC×GC/TOFMS分析，所得二维、三维图谱如图4、5所示.

图4 GC×GC/TOFMS分析菌株降解石油烃产物的二维谱图

图5 全二维气相色谱/飞行时间质谱分析菌株降解石油烃产物的三维谱图

由图4、5可知，采用GC×GC/TOFMS对微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃产物进行分析，产物中的不可分辨的复杂混合物UCM中的组分被分离、检测.所检测到的组分共计1 900多种，主要包括未彻底降解的石油烃组分和菌株降解石油烃的中间产物，对其中的主要组分进行分析，结果列于表2、3.

石油烃的组分复杂，主要包括饱和烃类，如直链烷烃、支链烷烃和环烷烃等，还有不饱和烃类主要有烯烃、炔烃、单环芳烃、多环芳烃、杂环芳烃等[14].由表2中未彻底降解的石油烃组分可知，在好氧条件下，石油烃组分中的大部分C10-C28正构烷烃均被嗜酸寡养单胞菌降解.未降解的组分中，最多的是多环芳烃如1，4，5-三甲基-萘、2，6-二甲基萘、5-甲基-1，2，3，4-四氢-萘、1，2，3，4，5，6，7，8-八氢-蒽、菲等.还有部分支链烷烃和环烷烃，支链烷烃有2，6，10，14-四甲基-十七烷、2，6，10-三甲基-十二烷、3-乙基-辛烷、3-甲基-十三烷、2-甲基-5-丙基-壬烷等，环烷烃有己基-环己烷、亚乙基-环戊烷、金刚烷等.这说明，石油烃组分中，链长度中等(C10-C24)的正构烷烃最容易被微生物降解，菌株降解石油烃组分由易到难的顺序为：直链烷烃>支链烷烃>芳香烃、环烷烃，这与已有的研究结论一致[15].

表2 未彻底降解的石油烃组分

续表3

在好氧条件下，微生物降解石油烃的最终产物通常为CO2、H2O等.在降解过程中，微生物降解不同石油烃组分的途径各不相同，产生的中间产物也有所差异.由表3列出的嗜酸寡养单胞菌降解石油烃的中间产物可以推断，菌株在有氧条件下，降解石油烃组分的中间产物主要有醇、酮、有机酸及酸酐等.其中，直链烷烃如十六烷，在微生物作用下，生成中间产物鲸蜡醇，接着被氧化为十六醛和脂肪酸，脂肪酸被进一步氧化，最终生成CO2和H2O，直链烷烃的中间产物有7-十四醇、二十八烷醇、鲸蜡醇、17-硬酯酸等；与直链烷烃相比，支链烷烃较难被降解，其降解途径和直链烷烃相似，检测到的中间产物有2-己基-1-十二醇、2-辛基-1-癸醇、2-甲基-1-辛醇等；环烷烃先被氧化为环醇，接着形成环酮，然后被进一步降解，检测到的中间产物有1-环己醇、环辛烷甲醇、3-甲基环戊醇、环庚烷甲醇等；芳香烃很难被该菌株降解，烷基芳香烃被氧化成羧酸，芳香烃苯环被羟基化，随后进行芳环裂解，多环芳烃残留较多，检测到的中间产物有间苯二甲酸等.以上结论与杨丽芹等人的研究结论一致[16].

表3 菌株降解石油烃中间产物表

3 结 论

(1)采用GC对微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃进行分析，80%以上的石油烃被降解，降解后的气相色谱图中，出现了不可分辨的复杂混合物UCM.

(2)采用GC×GC/TOFMS对微嗜酸寡养单胞菌降解石油烃产物进行分析，产物中不可分辨的复杂混合物UCM中的组分被分离、检测.检测结果表明，石油烃组分中的大部分C10-C28正构烷烃被嗜酸寡养单胞菌好氧降解.未降解的组分中，最多的是多环芳烃，还有部分支链烷烃和环烷烃.

(3)由检测结果推断嗜酸寡养单胞菌降解不同石油烃组分的途径为：直链烷烃如十六烷在微生物作用下生成中间产物鲸蜡醇，接着被氧化为十六醛和脂肪酸，脂肪酸被进一步氧化，最终生成CO2和H2O；支链烷烃的降解途径和直链烷烃相似；环烷烃先被氧化为环醇，接着形成环酮，然后被进一步降解；芳香烃很难被该菌株降解，烷基芳香烃被氧化成羧酸，芳香烃苯环被羟基化，随后进行芳环裂解，多环芳烃大部分不能被降解.