流动相对液相色谱法测量乳制品中三聚氰胺影响的探究
2022-02-22陈茂姣邓燕琴何娓娓张红梅
陈茂姣,邓燕琴,何娓娓,兰 宁,张红梅
四川新希望乳业有限公司洪雅阳平分公司,四川眉山 620360
0 引言
高效液相色谱法因其具有测量精度高、稳定性好、测量结果准确等特点,被广泛应用在定量检测中。但检测结果也受到很多因素的影响[1],比如仪器的各项参数设置、色谱柱的种类和长短、色谱柱的填充物和孔径、流动相的比例等。其中流动相的比例对目标物的出峰时间、峰型的良好与否有很大的关系。不适宜的流动相有可能造成双峰、拖尾峰、峰展宽、保留时间不断变动、灵敏度不高的问题,检测出的结果也不可靠,可能会导致假阳性或假阴性。合适的流动相比例可以使目标物的峰型左右对称,与杂峰分离良好,获得可靠的试验结果。本文通过液相色谱仪检测三聚氰胺的含量[2],研究不同流动相比例对三聚氰胺检测结果的影响,从而找出方法中最适宜检测三聚氰胺的流动相比例。
1 试验流程
本文使用方法为《GB/T 22388—2008 原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》中的第一法高效液相色谱法。待测样品经过三氯乙酸和乙腈的提取后[3],经阳离子交换固相萃取柱净化,氮吹后用流动相定容,经有机滤头过滤后,用高效液相色谱测定,外标法定量。
2 试验方法
2.1 试验试剂与材料
甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯),默克化工技术(上海)有限公司;三氯乙酸(优级纯)、氨水(分析纯),成都市科隆化学品有限公司;柠檬酸(分析纯),福晨(天津)化学试剂有限公司;辛烷磺酸钠(优级纯),成都市科隆化学品有限公司;三聚氰胺标准品(纯度≥99.5%),上海安谱实验科技股份有限公司。
配制离子对试剂缓冲液:准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠,加入约980 mL水溶解,调节pH至3.0后,定容至1 L备用。
2.2 试验仪器
高效液相色谱仪[LC-1260(VWD)],安捷伦科技(中国)有限公司;涡旋振荡器,上海泸析实业有限公司;调速多用振荡器,常州市凯航仪器有限公司;超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;分析天平,上海民桥精密科学仪器有限公司。
2.3 标准曲线
分别移取0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、2.5 mL、5.0 mL浓度为100 mg/L的三聚氰胺标准储备液于100 mL容量瓶中,用流动相分别定容至刻度线,混匀备用,得到0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L的标准曲线。
标准曲线是使用流动相进行定容的,测试不同流动相比例需要重新配制相应的标准曲线。
2.4 仪器参数
2.4.1 色谱柱
C18柱,4.6×250 mm,5μm,安捷伦科技(中国)有限公司。
2.4.2 参数设置
进样量:20μL;波长:240nm;柱温:40 ℃;流速:1 mL/min。
2.4.3 流动相
离子对试剂缓冲液和乙腈按照不同比例混匀。
2.5 具体步骤
称取2 g(精确至000.1 g)试样于50 mL离心管中,加入15 mL 2%三氯乙酸溶液和5 mL乙腈,超声10 min,取出后震荡10 min,最后6000 r/min离心10 min,离心后的上清液经定性滤纸过滤至25 mL比色管中,用2%三氯乙酸溶液定容至25 mL。取5 mL滤液与5 mL超纯水混匀,经固相萃取柱净化后,用5%的氨化甲醇洗脱,收集洗脱液,在50 ℃水浴下用氮吹仪吹至近干,最后用1 mL流动相定容,用0.22 μm有机滤头过滤后上机测定。
每次上机检测需要测定标准曲线(当前流动相比例定容)、标准曲线的标准点连续测3 次、阴性本底、阴性本底加标,并做三次平行。观察标准曲线的出峰时间、本底加标的回收率、标准点的峰型与峰面积相对标准偏差。
3 试验结果
3.1 流动相比例为85:15的检测结果
离子对试剂缓冲液与乙腈的比例为85:15时,出峰时间为9 min左右,回收率为91.9%~92.0%,但分离度不好,与杂峰有粘连,如表1和图1所示。
表1 流动相比例为85:15的检测结果
图1 流动相比例为85:15的峰型
3.2 流动相比例为88:12时的检测结果
离子对试剂缓冲液与乙腈的比例为88:12时,出峰时间为12.9 min左右,回收率为79.9%~84.8%,回收率差,且峰型有轻微拖尾,如表2和图2所示。
表2 流动相比例为88:12的检测结果
图2 流动相比例为88:12的峰型
3.3 流动相比例为90:10时的检测结果
离子对试剂缓冲液与乙腈的比例为90:10时,出峰时间为17.3 min左右,回收率为92.1%~96.2%,分离度较好,峰型左右对称,如表3和图3所示。
表3 流动相比例为90:10的检测结果
图3 流动相比例为90:10的峰型
3.4 流动相比例为92:8时的检测结果
离子对试剂缓冲液与乙腈的比例为92:8时,出峰时间为24.5 min左右,回收率为82.5%~86.2%,但分离度不好,杂峰较多,如表4和图4所示。
表4 流动相比例为92:8的检测结果
图4 流动相比例为92:8的峰型
3.5 流动相比例为95:5时的检测结果
离子对试剂缓冲液与乙腈的比例为95:5时,出峰时间为40.7 min左右,出峰时间太长,回收率为89.3%~109.9%,回收率不稳定,与杂峰分离度不好,峰拖尾,如表5和图5所示。
表5 流动相比例为95:5的检测结果
图5 流动相比例为95:5的峰型
4 结论
流动相中离子对试剂缓冲液与乙腈的比例对检验结果起着至关重要的作用。乙腈含量高时,目标峰出峰时间相对短一些,能提高检测速度,乙腈含量低时,目标峰出峰时间相对长一些,检测时间较长。选择流动相比例时要综合考虑目标峰保留时间的长短,与杂峰和溶剂峰的分离度,峰型,是否拖尾,目标物的回收率等情况[3]。流动相比例为92:8与95:5时,目标峰出峰时间较迟,会导致检测速度过慢。比例为92:8时杂峰较多,与溶剂峰分离度不好,回收率为82.5%~86.2%。流动性比例90:10时保留时间为17.3 min左右,保留时间合适,且回收率较好,分离度好,峰型左右对称,为最佳比例。