甘草泻心汤联合血竭对DSS诱导的UC模型大鼠的抗炎作用*

李敏

(川北医学院附属医院，四川 南充 637000)

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是炎症性肠病的一种，以反复或持续发作的黏液脓血便、腹泻、腹痛、里急后重及不同程度的肠外并发症为主要临床表现[1-2]。病变部位以结肠的黏膜及黏膜下层为主[3]，其患病率逐年上升，每千人中约有1～2人患病[4]，已成为全球性的疾病[5]。UC的发病与遗传、免疫、环境及上皮屏障缺陷等因素有关[6]，细胞因子在UC的免疫反应和局部炎症反应中起重要作用。白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumornecrosis actor-2,TNF-α)是参与UC炎症级联反应的主要细胞因子，能促进白细胞活化，使肠道黏膜炎症反应持续[7-8]。UC是导致相关性结直肠癌发生的危险因素之一[9]，UC患者患结直肠癌的风险是正常人群的5倍[10]。目前，UC的治疗以缓解症状为主，难以彻底治愈。氨基水杨酸、皮质类固醇和免疫抑制剂是治疗UC的主要化学药物，但长期用药的不良反应多，治疗费用高，部份患者疗效并不理想[11]，寻找新的有效的UC治疗药物与方法亟待解决。中医中药对UC的治疗起到了一定的作用[12]，研究表明甘草泻心汤具有抗溃疡、调节机体免疫功能的作用，已广泛用于消化系统和免疫系统等疾病的治疗[13-14]。中药血竭具有活血止血、敛疮生肌之功。课题组前期研究发现甘草泻心汤和血竭对UC大鼠有显著的治疗效果[15]。本研究旨在进一步探讨甘草泻心汤联合血竭对硫酸葡聚糖钠(dextran sulfate sodium,DSS)诱导的UC模型大鼠的疗效及对血清IL-6和TNF-α的影响，为甘草泻心汤联合血竭防治UC的合理使用提供参考。

1 仪器与材料

1.1主要仪器设备 BMJ-Ⅲ石蜡包埋机(常州中威电子仪器有限公司)；PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪(常州中威电子仪器有限公司)；RM2125RTS切片机(德国LEICA公司)；CX41-12C02显微摄像系统(日本Olympus株式会社)。

1.2试药 甘草泻心汤(炙甘草12 g，黄连3 g，黄芩9 g，半夏9 g，干姜9 g，大枣6 g，人参9 g)药材饮片，由川北医学院附属医院药剂科提供。按原方比例将药物饮片按中药常规煎煮法煎液，浓缩为含生药2.4 g·mL-1溶液备用。龙血竭胶囊(0.3 g×60粒)，云南云河药业有限公司，批号：150408。取胶囊内容物，用浓缩甲基纤维素钠与甘草泻心汤药液配制成每毫升含血竭0.15 g生药的混悬液备用。柳氮磺吡啶片(sulfa salazine,SASP，0.25 g×60片)，上海信谊天平药业有限公司，批号09161007。研成粉末，用浓缩甲基纤维素钠与生理盐水配制成每毫升含0.17 g生药的混悬液备用。硫酸葡聚糖钠(DSS)，上海西宝生物科技有限公司(OS1701A)。大鼠TNF-α试剂盒，上海酶联生物科技有限公司(mL002859-J)；大鼠白细胞介素6(IL-6)试剂盒，上海酶联生物科技有限公司(mL102828-J)。

1.3实验动物 SD(sprague dawley)大鼠，SPF(specific pathogen free,DPF)级，雌雄各半，体质量(180±20)g，由川北医学院实验动物中心提供。动物生产许可证号：SCXK(川)2018-18，动物使用许可证号：SYXK(川)2018-076。严格遵循实验动物保护与使用的准则。

2 实验方法

2.1动物分组、造模与给药 取SD大鼠100只，实验开始时称体质量2次，取其平均值作为初始体质量，按随机数字表法分成空白组25只与造模组75只，空白组大鼠自由进食进饮，造模组参照文献[16]，以3%葡聚糖硫酸钠溶液代替饮用水自由饮用7 d制作大鼠UC模型，大鼠出现大便次数增多伴稀便、便中带黏液和(或)血迹、体质量下降提示造模成功。造模成功后大鼠随机分成模型组、柳氮磺吡啶组及甘草泻心汤+血竭组各25只。根据《中药药理研究方法学》中[17]动物给药量计算：60 kg成人与200 g大鼠折算系数为6.25。大鼠等效剂量：柳氮磺吡啶用量为450 mg·(kg·d)-1，甘草泻心汤用量为6 g·(kg·d)-1，血竭用量为375 mg·(kg·d)-1。柳氮磺吡啶组每天给予柳氮磺吡啶混悬液2.5 mL/只灌胃，甘草泻心汤+血竭组每天给予甘草泻心汤+血竭混悬液2.5 mL/只灌胃，空白组、模型组每天给予生理盐水2.5 mL/只灌胃，连续灌胃7 d。

2.2观察指标

2.2.1疾病活动指数评分 实验期间每日观察记录大鼠体质量、粪便性状和便血情况，用联苯胺法检测大便隐血，并参照文献[18]进行疾病活动指数(Disease activity index，DAI)评分，标准见表1。

表1 DAI评分标准

2.2.2酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)测定各组大鼠血清IL-6、TNF-α含量 治疗7 d后，各组大鼠分别给予10%水合氯醛溶液4 mL·kg-1腹腔注射麻醉。解剖大鼠，心脏采血，抽取新鲜血液约4 mL/只，2 h内离心，留取上清液，-80 ℃低温保存，临用前2 d放入4 ℃环境解冻，酶联免疫吸附法测定各组大鼠IL-6、TNF-α血清含量。

2.2.3肠黏膜损伤及病理组织学评分 取血后各组大鼠处死，解剖，取肛门至回盲部的肠道组织，顺着肠系膜剪开，用冰生理盐水冲洗干净，铺平，观察结肠黏膜有无水肿、出血点、糜烂及溃疡情况。参照文献进行结肠黏膜损伤(colonmucosa damage index，CMDI)评分[19]，标准见表2。在距肛门及回盲部0.5 cm处各取1块肠组织，约0.5 cm×0.5 cm，置生理盐水中清洗，10%福尔马林溶液固定，常规石蜡包埋、切片、行苏木精-伊红(hematoxylineosin，HE)染色，显微镜下观察组织学改变，参照文献行病理组织学(histopathology，HS)评分[20]，标准见表3。

表2 CMDI评分标准

表3 HS评分标准

3 实验结果

3.1对UC大鼠一般情况及DAI评分的影响 空白组大鼠反应敏捷，毛发柔顺光滑，进食及饮水如常，大便正常；模型组大鼠出现不同程度的皮毛干枯、精神不振、倦怠懒动、扎堆、厌食、腹泻、大便带血、体质量减轻等症状。灌胃后甘草泻心汤+血竭组和SASP组大鼠毛色逐渐转柔润光滑，精神逐渐恢复正常，爱活动，进食量增加，便血消失，大便逐渐成型并转为颗粒状，体质量增加。模型组大鼠体质量低于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，模型组DAI评分高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组大鼠体质量高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)，甘草泻心汤+血竭组和柳氮磺吡啶组DAI评分低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 对UC大鼠一般情况及DAI评分的影响

3.2对UC大鼠CDMI及HS评分的影响 结肠组织洗净铺平后见：空白组结肠粘膜淡红、润滑，粘膜皱襞完好，未见充血、水肿及溃疡；模型组结肠粘膜充血、水肿明显，粘膜脆性增加，肠腔管壁增厚粘连，远端结肠粘膜可见多个椭圆形溃疡；柳氮磺吡啶组和甘草泻心汤+血竭组见肠粘膜轻度充血、水肿，远端结肠粘膜少许糜烂面。HE染色后镜下见：空白组大鼠结肠黏膜形态完好，腺体整齐排列，杯状细胞分布正常，未见水肿及溃疡；模型组肠黏膜腺体排列紊乱，肠黏膜上皮部分损坏，粘膜部分缺损，散在多个溃疡，隐窝和杯状细胞大面积丢失，黏膜和黏膜下层可见较多炎症细胞浸润；柳氮磺吡啶组和甘草泻心汤+血竭组结肠粘膜腺体排列欠整齐，粘膜上皮少许缺损，杯状细胞和隐窝均出现不同程度的修复，较多腺体增生，隐窝及间质有少许炎细胞浸润。模型组、柳氮磺吡啶组及甘草泻心汤+血竭组大鼠CMDI、HS评分均高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)；柳氮磺吡啶组和甘草泻心汤+血竭组CMDI、HS评分均低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组HS评分低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1、表5。

表5 对UC大鼠CDMI及HS评分的影响

A.空白组；B.模型组；C.柳氮磺吡啶组；D.甘草泻心汤+血竭组

3.3对UC大鼠血清IL-6、TNF-α的影响 模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量高于空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，柳氮磺吡啶组和甘草泻心汤+血竭组IL-6、TNF-α含量低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)；甘草泻心汤+血竭组IL-6、TNF-α含量低于柳氮磺吡啶组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6。

表6 对UC大鼠血清IL-6、TNF-α的影响

4 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性肠病，主要病理表现为结肠粘膜损伤。此病反复发作，迁延难愈，其发病率逐年升高[21]。而长期的炎症、溃疡引起的相关性结肠癌风险也逐年增高，病程超过30年的癌变率可高达30%[22]。目前，UC的病因及发病机制尚未完全明确，大多认为与遗传、环境、免疫、肠道菌群有关[23-24]，治疗上只能缓解症状而不能完全治愈，所用化学药物主要有氨基水杨酸类、激素、免疫抑制剂等，但长期用药的不良反应和高昂的费用显著降低了患者的生活质量和满意度。研究表明甘草泻心汤和血竭具有良好的抗炎和免疫调节等作用[14-15]，因此本研究采用甘草泻心汤联合血竭灌胃治疗DSS诱导的UC模型大鼠，观察其抗炎作用及对血清TNF-α与IL-6含量的影响。

溃疡性结肠炎造模方法很多，包括化学法、基因法、免疫复合法、中医模型等[25]，而化学法中硫酸葡聚糖钠(DSS)诱导的UC模型具有简单方便和与人的溃疡性结肠炎相似性被广泛应用[26]。DSS是一种水溶性硫酸化多糖，可通过直接对肠道上皮细胞产生毒性作用、改变结肠黏液层菌群及引起肠上皮细胞缺氧来损坏肠道屏障，从而引起溃疡性结肠炎的发生，表现为腹泻、直肠出血、溃疡和粒细胞浸润，这与人类溃疡性结肠炎临床特点和组织学表现相似[27]。DSS诱导UC的发生发展与促炎因子TNF-α、IL-6的表达增高密切相关[28-29]，而分子量40000的DSS诱导的结肠炎病变主要表现在远端结肠。DSS的浓度对结肠黏膜损伤程度有决定作用，以3% DSS诱导大鼠UC模型为最佳[30]，所以本研究采用分子量40000的3%DSS诱导UC大鼠模型。

中医药理论认为溃疡性结肠炎以反复发作的痛泄粘液脓血便为主要表现，其病候学特点与中医病名“休息痢”相符。脾虚为其发病之本，湿邪为致病之标，血瘀为局部病理变化[31]。湿和瘀既是致病之因，又是病理产物，湿与瘀交结，蕴于肠间，互相影响，寒热错杂，导致UC经久不愈，在患者感受外邪、饮食不当、劳累、情志变化时诱发，这是UC反复发作而不能治愈的根本原因。因此，益气健脾、除湿化瘀是缓解UC发作，也是防止其复发的关键[32]。甘草泻心汤出自《伤寒杂病论》，由甘草、半夏、黄芩、黄连、干姜、大枣、党参组成，该方补清结合，补中寓清，是治疗湿阻中焦，脾胃虚弱，寒热错杂的经典方，被称为黏膜修复剂，具有抗溃疡、调节黏膜分泌和机体免疫功能的作用，能促进UC肠道屏障功能修复[13-14]。中药血竭具有散瘀定痛、止血生肌之功，能改善局部血液瘀滞状态，调节免疫，促进结肠粘膜溃疡愈合[15]。甘草泻心汤联合血竭抓住了UC患者湿伏血瘀、脾胃虚弱的病机特点，既能健脾益气，除肠间之湿，又能行内瘀之血，使内伏湿瘀得除，消除致病之因和病理产物而达到治疗和防止UC再发的作用。

TNF-α、IL-6都是重要的促炎症细胞因子，TNF-α能激活上皮细胞，诱导趋化因子，使中性粒细胞聚集，使炎症效应放大，损伤肠黏膜组织，其在血清中含量与UC严重程度呈正相关[33]。IL-6能诱导细胞因子的表达，使TNF-α的生物学活性增强，使炎症反应加重，其在血清中含量可反映UC的严重程度[22]。本研究表明，大鼠造模后出现精神不振、倦怠、厌食、腹泻、大便带血、体质量减轻，结肠粘膜充血、水肿，肠腔管壁增厚粘连，肠黏膜腺体排列紊乱，上皮损坏及溃疡形成，隐窝和杯状细胞大面积丢失，较多炎症细胞浸润，DAI、CMDI及HS评分明显高于空白组(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6的含量较空白组显著增高(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组灌胃后，大鼠精神逐渐恢复，活动量及进食量增加，大便逐渐成型并转为颗粒状，便血消失，体质量增加，肠粘膜充血、水肿、糜烂减轻，杯状细胞和隐窝不同程度的修复，较多腺体增生，炎性细胞浸润减少。DAI、CMDI及HS评分较模型组显著降低(P<0.05)，血清TNF-α、IL-6的含量也显著低于模型组(P<0.05)。甘草泻心汤+血竭组HS评分及血清TNF-α、IL-6的含量低于柳氮磺吡啶组(P<0.05)。表明甘草泻心汤联合血竭能消除UC模型大鼠的症状，促进损伤的肠粘膜炎症消退并修复，改善结肠粘膜的病理损害，降低血清TNF-α、IL-6的含量，具有明显的抗溃疡性结肠炎作用。

综上所述，甘草泻心汤联合血竭灌胃能改善DSS诱导的UC模型大鼠腹泻及粘液血便的症状，降低UC大鼠结肠DAI、CMDI及HS评分，抑制UC大鼠血清TNF-α、IL-6的表达，具有明确的抗溃疡性结肠炎作用。