超声耦合双水相体系提取茶皂素的工艺优化与机制探讨

2022-02-22杜金婷张雁李雁王佳佳廖娜钟立煌骆碧群林江

中国农业科学 2022年1期

杜金婷，张雁，李雁，王佳佳，廖娜，钟立煌，骆碧群，林江

1广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室，广州 510610；2华南农业大学食品学院，广州 510640；3广东星汇生物科技有限公司，广东龙川 517323

【】茶皂素是一种具有广阔应用前景的天然活性物质，纯度是限制其应用和价值的关键因素。探究超声耦合双水相提取（Ultrasound-assisted two-phase aqueous extraction, UAATPE）油茶粕茶皂素的工艺条件及其提取机制，以开发纯度高且高效的提取技术，为油茶粕高值化利用提供技术指导。以油茶粕为原料，在单因素基础上，利用Plackett-Burman设计筛选影响得率的关键因素，经Box-Behnken设计优化提取工艺；通过比较传统乙醇提取法和水提法的提取物得率和纯度，评价UAATPE法茶皂素提取效果；结合扫描电子显微镜分析油茶粕微观结构，初步探讨UAATPE法提取机制。影响茶皂素得率的关键因素为乙醇质量分数、硫酸铵质量分数和超声时间，经Box-Behnken设计优化的最佳工艺参数为：乙醇质量分数27.50%（w/w），硫酸铵质量分数19.60%（w/w），液固比50﹕1，超声时间32 min，超声功率300 W，提取温度60℃，在此条件下茶皂素得率为（26.21±0.54）%。与传统乙醇提取法相比，UAATPE法的茶皂素得率虽差异不显著，但其纯度提高了6.57%（＜0.05）。相较于传统水提法，UAATPE法提取的茶皂素得率和纯度分别提升了17.74%和40.23%（＜0.01）。微观结构显示UAATPE法处理的油茶粕因超声波空化效应，加剧了油茶粕组织破坏，产生大量空洞和强烈表面收缩，有效促进油茶粕茶皂素释放。UAATPE提取过程，茶皂素在双水相系统中首先经过固液提取进入电导率高的底相，然后经液液萃取迁移至极性较大的顶相，从而达到初级纯化，提升茶皂素纯度的效果。采用UAATPE法可以显著提高茶皂素得率和纯度，为油茶粕的高效利用提供了新方法。

油茶粕；茶皂素；超声波；双水相提取；Plackett-Burman设计；响应面设计

0 引言

【研究意义】油茶是世界四大油料作物之一，被誉为“东方油橄榄”，2019年我国油茶种植面积已达6 800万hm2，油茶籽产量达267万t，经榨油后可产生100多万t油茶粕[1-2]。茶油是具有食疗双重功能的一种食用油，相较于橄榄油，其具有更高的不饱和脂肪酸及能有效改善心脑血管疾病、降低胆固醇并抑制癌细胞生物活性物质的茶多酚和山茶甙[3-4]。油茶粕是一种富含茶皂素且可产生较高经济价值的加工副产物，然而其综合利用程度低，目前主要用于生产燃料和清塘剂，经济效益不高。茶皂素具有抗菌、胃肠保护、抗癌、降血脂等[5-8]生物活性和良好的表面活性，在医药、农业、工业和环境保护等领域具有广阔的应用前景。茶皂素纯度是限制其应用领域和经济价值的关键因素，目前市场上流通的多为低纯度茶皂素，而低纯度茶皂素无法应用于食品和医药等领域且经济价值较低。因此，寻找简单高效、提取纯度高且低成本的提取技术以运用于工业生产具有重要意义。【前人研究进展】由于茶皂素结构复杂，使其提取困难[9]，传统提取方法有水提法和有机溶剂法，但都存在提取效率不高、纯度较低等问题。李扬[10]采用水提法提取茶皂素，提取时间3.5 h时茶皂素得率为22.09%，侯如燕[11]采用水提法提取茶皂素，纯度仅为45.23%；笔者课题组前期建立了茶皂素连续多级逆流水提工艺[12]，相较于传统的单级水提取技术，极大缩短了提取时间，但在提取物得率和纯度方面尚无较大突破；水提法工艺简单、成本较低，但提取物纯度低，限制了后续应用。孙万里[13]以乙醇为提取剂提取茶皂素，得率为21.5%，于辉等[14]采用正丙醇提取茶籽粕中茶皂素，提取物纯度为62.78%；与水提法相比，有机溶剂法提取物茶皂素纯度有显著提高，但存在溶剂成本高的问题。近年来，在有效成分提取及利用方面，辅助技术与双水相体系结合的新方法因其效率高、能耗低且不破坏物质结构的优点受到很多关注。LIN等[15]利用微波辅助双水相提取香菇多糖，其提取率和纯度皆高于热回流提取法和单一微波提取法。ZHAO等[16]采用微波辅助双水相提取黑加仑皮多酚，多酚结构无破坏，且对食源性病原菌的抗菌效果与标准品无显著差异。【本研究切入点】目前关于茶皂素提取方法的研究主要集中在有机溶剂提取与辅助技术相结合等方面，双水相萃取因其效率高、成本低及活性物质损失少等优点，已广泛应用于蛋白纯化和抗生素提取，但关于天然活性成分双水相提取工艺的研究报道较少，而采用辅助技术与双水相体系结合提取茶皂素的研究尚未见报道。因此，探究双水相体系与超声辅助技术耦合的提取工艺及机制，可以提升茶皂素纯度，降低生产成本，提高油茶粕深加工产品的附加值。【拟解决的关键问题】采用Plackett-Burman和响应面设计确定UAATPE法提取油茶粕茶皂素最佳工艺参数，以茶皂素得率和纯度两个考察指标评价UAATPE法对油茶粕茶皂素的提取效果；同时结合扫描电子显微镜分析UAATPE法提取的油茶粕微观结构，对其提取机制进行初步分析，以期为油茶加工副产物油茶粕的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

试验于2020年9月至2021年5月在广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所进行。

1.1 材料与试剂

油茶粕：由广东星汇生物科技有限公司提供，油茶籽产自广东省河源市龙川县黄石镇长洲村，于2020年11月采收，脱脂油茶粕基本成分含量（以干基计）：茶皂素29.75%，糖类28.56%，粗蛋白22.96%；茶皂素标准品（纯度≥98%）：购于北京谱析科技有限公司；硫酸铵、磷酸氢二钾：购于福晨（天津）化学试剂有限公司，均为分析纯；色谱级甲醇：购于北京迈瑞达科技有限公司；冰乙酸：购于天津市科密欧化学试剂有限公司，高效液相色谱仪专用。

1.2 仪器与设备

BSA4202S电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；QUINTIX224-1CN分析天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；M308073漩涡混合器，北京中西华大科技有限公司；AIIera X 64R台式冷冻高速离心机，美国贝克曼库尔特公司；SB25-12DTD超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司；SOX416脂肪测定仪，德国格哈特分析仪器有限公司；LC1260高效液相色谱，安捷伦科技有限公司；S-3400N-II扫描电子显微镜，日立高新技术公司。

1.3 试验方法

1.3.1 双水相体系（aqueous two-phase system，ATPS）相图绘制在25℃室温下，通过浊点滴定法确定相图，将一定量的(NH4)2SO4或K2HPO4分别添加到装有去离子水的试管中，随后将乙醇滴加到每个试管中，直到溶液变浑浊为止，将溶液首先变得浑浊的点定义为浊点，记录乙醇添加量，分别以浊点出现时对应的盐和乙醇的质量分数为横纵坐标绘制相图。

1.3.2 ATPS的筛选制备乙醇质量分数为25%，盐质量分数为20%的两种双水相系统，将(NH4)2SO4或K2HPO4分别溶解在去离子水中，通过涡旋搅拌器将盐溶液与乙醇混合，当混合物在浊点处出现两相分离，就会形成双水相系统。将0.5 g样品和25 g双水相系统放入离心管中，然后密封放入超声波清洗仪，在50℃、300 W的条件下超声提取30 min，冷却离心后，清液进一步分为两相，并将顶部和底部分别收集，测定茶皂素含量。通过茶皂素分配系数（K）、回收率（R）和相比（α）来评估提取效果，其计算如下：

×100% （2）

（3）

式中，CT：顶相茶皂素浓度（mg∙mL-1）；CB：底相茶皂素浓度（mg∙mL-1）；mT：顶相中茶皂素含量；mB：底相中提取的茶皂素含量；Vtop：顶相体积；Vbottom：底相体积。

1.3.3 超声耦合双水相提取流程将油茶粕置于烘箱内，60℃烘干24 h，研磨，过80目筛，再经索氏提取器脱脂。准确称量0.5 g脱脂油茶粕粉置于装有一定梯度乙醇质量分数、盐质量分数的25 g双水相系统的50 mL离心管中，密封后置于超声清洗仪，实时监测水温，并用碎冰控制温度恒定。在一定提取温度、超声时间和超声功率下进行提取，提取结束后7 000 r/min、20℃离心10 min，收集上清液，用于试验分析。

1.3.4 茶皂素得率测定

1.3.4.1 液相条件采用文献报道的方法，略有修改[17]。流动相A：甲醇；B：0.4%乙酸溶液；流速：1.0 mL∙min-1；检测波长：280 nm；色谱柱：inertsil ODS-3 C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；进样量：20 μL；柱温：40℃。

梯度洗脱程序如表1所示。

表1 梯度洗脱条件

1.3.4.2 专属性试验精密吸取标准品溶液、提取液，依法测定，记录色谱图（图1）。提取液色谱中，在与标准品溶液色谱相应位置上有相同保留时间的色谱峰。

图1 标准品（A）、提取液样品（B）HPLC色谱

1.3.4.3 茶皂素得率测定采用高效液相色谱测定茶皂素得率，准确称取80 mg茶皂素标准品，用50%乙醇溶剂溶于10 mL容量瓶中，定容配成8 mg∙mL-1的标准溶液，吸取5 mL标准溶液于10 mL具塞试管，加入5 mL 50%乙醇，配成4 mg∙mL-1的标准溶液，依次稀释配置2、1和0.5 mg∙mL-1的标准溶液。在高效液相色谱条件下测定峰面积，以峰面积为纵坐标，茶皂素浓度（mg∙mL-1）为横坐标，得到茶皂素回归方程为：=119578.90+232.21，2=0.9998，线性相关性良好。过滤茶皂素提取液后用分液漏斗将上、下两相分离，取茶皂素提取上清液定容至50 mL后，采用高效液相色谱法测定茶皂素浓度，进一步代入以下公式计算茶皂素得率。

式中，：提取液中茶皂素浓度（mg∙mL-1），M0：油茶粕质量（mg）。

1.3.4.4 茶皂素纯度测定将茶皂素提取液旋转蒸发至膏状，之后放入烘箱中烘干至恒重得茶皂素提取物。将一定质量茶皂素提取物定容于10 mL容量瓶，取适量茶皂素溶液，采用高效液相色谱法测定茶皂素浓度，进一步代入以下公式计算茶皂素纯度：

式中，：茶皂素浓度（mg∙mL-1），M1：茶皂素提取物质量（mg）。

1.3.5 单因素试验

1.3.5.1 乙醇质量分数固定硫酸铵质量分数为20%、液固比为40﹕1、超声功率为300 W、超声波提取时间30 min、提取温度50℃，乙醇质量分数分别设为22%、24%、26%、28%和30%进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.5.2 硫酸铵质量分数固定乙醇质量分数为25%、液固比为40﹕1、超声功率为300 w、超声波提取时间30 min、提取温度50℃条件下，硫酸铵质量分数分别设为18%、20%、20%、22%和24%进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.5.3 液固比固定乙醇质量分数为25%、硫酸铵质量分数为20%、超声功率为300 w、超声波提取时间30 min、提取温度50℃条件下，液固比分别设为20﹕1、30﹕1、40﹕1、50﹕1和60﹕1进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.5.4 超声波功率固定乙醇质量分数为25%、硫酸铵质量分数为20%、液固比为40﹕1、超声波提取时间30 min、提取温度50℃条件下，超声波功率分别设为200、250、300、350和400 W进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.5.5 超声时间固定乙醇质量分数为25%、硫酸铵质量分数为20%、液固比为40﹕1、超声功率300 W、提取温度50℃条件下，超声波提取时间分别为20、30、40、50和60 min进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.5.6 提取温度固定乙醇质量分数为25%、硫酸铵质量分数为20%、液固比为40﹕1、超声功率300 W、超声波提取时间30 min条件下，提取温度分别设为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃进行茶皂素提取，测定茶皂素得率。

1.3.6 Plackett-Burman试验根据单因素试验结果，选取高、低两个水平进行Plackett-Burman试验，分析比较上述各因素效应值及其显著性筛选出显著影响茶皂素得率的因素。Plackett-Burman设计因素和水平见表2。

表2 Plackett-Burman设计的因素和水平

1.3.7 响应面试验设计采用Design Expert 8.0.6软件，以茶皂素得率为响应值，采用中心组合试验Box-Behnken Design（BBD），选定乙醇质量分数，硫酸铵质量分数，超声时间为自变量进行三因素三水平试验设计并对结果进行分析。试验因素及水平如表3所示。

表3 Box-Behnken 试验因素与水平

1.3.8 不同提取方法对比为评价超声辅助双水相提取法的提取效果，与提取时间60 min、液固比10﹕1和温度80℃条件下的传统乙醇提取法和水提法的茶皂素得率和产品纯度进行对比[18-19]。

1.3.9 不同提取方法的油茶粕微观结构用扫描电子显微镜观察不同提取方式对油茶粕表面微观结构的影响，初步探讨UAATPE法对油茶粕茶皂素的提取机制。

1.4 数据分析

每组试验重复3次，试验数据值以均值±标准差表示，采用Design Expert 8.0.6响应面设计软件对数据进行相应分析；采用SPSS 19软件对HPLC试验数据进行显著性差异分析（＜0.05，差异显著；＜0.01，差异极显著）；采用Excel 2019、Origin2021对数据进行统计分析及制图。

2 结果

2.1 双水相系统研究

2.1.1 双水相系统相图乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4两个典型的低分子有机溶剂/盐双水相系统具有相分离快、系统稳定透明的特点[20]，相图曲线描绘了两相区域，在曲线上方为系统两相区，该区域顶相是富含乙醇的醇相，底层是富含盐的水相，而在曲线下方则呈现浑浊溶液。由图2可知，乙醇/(NH4)2SO4系统的盐浓度上限约为35%（w/w），醇浓度上限约为60%（w/w），而乙醇/K2HPO4具有相似的盐浓度上限，然而其醇浓度上限约为45%（w/w），略低于乙醇/(NH4)2SO4系统。

2.1.2 双水相系统筛选如图3所示，乙醇/K2HPO4系统对茶皂素提取的分配系数（K）和回收率（R）均略高于乙醇/(NH4)2SO4系统，但无显著性差异（＞0.05），但乙醇/K2HPO4系统相比为3.14，是乙醇/(NH4)2SO4相比（0.93）的3.38倍。相较于分配系数和回收率，合适的相比（α）是一个更为重要的参数[21]，且相比在0.7—1.2范围内具有较优的提取效果[20]，综合考虑分配系数、回收率、相比和提取物的富集及操作简便性，选用乙醇/(NH4)2SO4作为提取试验的双水相系统。

2.1.3 双水相系统两相形成区研究两相形成区的研究可为进一步优化UAATPE的系统组成提供有效指导，图4显示，乙醇浓度从9.79%—37.63%（w/w），盐浓度从8.14%—30.07%（w/w）可适用于提取。综合考虑相比的适宜范围及图4中相比的研究结果，选用硫酸铵浓度为16%—24%（w/w），乙醇浓度为22%—30%（w/w）作为单因素优化范围。

图2 乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系统相图

图3 茶皂素在乙醇/(NH4)2SO4和乙醇/K2HPO4系统提取中的分配系数（K）、回收率（R）和相比（α）

图4 乙醇/(NH4)2SO4双水相体系相比

2.2 茶皂素提取单因素试验

2.2.1 乙醇质量分数当乙醇质量分数在22%— 30%，茶皂素得率随着乙醇质量分数增加呈现先增加后减少的趋势（＜0.05），而当乙醇质量分数为28%时，茶皂素得率最大（图5）。在一定范围内，随着乙醇质量分数的增加，顶相中有机溶剂的含量会增大，这有助于提升顶相提取能力[22]；而当乙醇质量分数过高时，顶相会溶解醇溶性杂质、色素等，从而降低茶皂素在顶相中的溶解度，导致得率降低[23]。因此，乙醇质量分数选择26%、28%、30%三个水平进行组合试验。

不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。下同

2.2.2 硫酸铵质量分数当硫酸铵质量分数在16%—20%，茶皂素得率呈轻微上升趋势（图6），可能是由于硫酸铵质量分数的增加使有机相中水分降低极性增强，进而增加茶皂素溶解度和扩散系数，促使茶皂素由内向外扩散[24]，提升茶皂素得率。然而上升趋势不显著可能是由于硫酸铵质量分数在16%—18%时，双水相体系较不稳定，成相能力较低。而当硫酸铵质量分数超过20%时，茶皂素得率随硫酸铵质量分数的增加呈现显著降低的趋势（＜0.05）。这可能是由于硫酸铵质量分数的增加，上相趋于饱和状态，随后继续增加硫酸铵质量分数会使顶相中的茶皂素向底相迁移。此外，硫酸铵质量分数过高会使双水相体系中硫酸铵沉淀析出，影响茶皂素浸出[25]，导致分配系数下降，从而降低茶皂素得率。因此，硫酸铵质量分数选择18%、20%、22%三个水平进行组合试验。

2.2.3 液固比茶皂素得率随着液固比增加呈现先增加后显著降低的趋势（＜0.05），当液固比达到50﹕1时，茶皂素得率取得最大值（图7）。其原因可能是随着液固比的增加，溶剂渗透并扩散到油茶粕细胞内，造成细胞内外浓度梯度增大，而浓度梯度作为传质动力促进油茶粕中茶皂素释放[26]；另外，溶剂在油茶粕细胞内可破坏疏水键，增加油茶粕中茶皂素由内向外的扩散速率，使其得率提高[27]。但当液固比超过50﹕1时，茶皂素得率显著降低（＜0.05），其原因可能是由于液固界面存在传质极限，细胞内外浓度梯度差趋于零，体系已经达到饱和状态，过量溶剂不但稀释茶皂素，而且也会使后续茶皂素的分离更难[28]。综上所述，液固比选择40﹕1、50﹕1、60﹕1三个水平进行组合试验。

图6 硫酸铵质量分数对茶皂素得率的影响

2.2.4 超声波功率随着超声波功率的增大，茶皂素得率逐渐增加，但在300 W后出现显著下降（＜0.05）（图8），这是因为超声波空化作用有利于茶皂素从细胞壁中释放，但当超声波功率过大时，可能会破坏茶皂素的结构[29]。研究表明，皂苷类物质在功率过高的超声波作用下会造成糖苷分离，导致皂苷降解，进而使茶皂素得率降低[30-31]。因此，从降低能耗和得到高品质茶皂素的角度考虑，超声波功率选择250、300和350 w三个水平进行组合试验。

图7 液固比对茶皂素得率的影响

图8 超声波功率对茶皂素得率的影响

2.2.5 超声时间茶皂素得率随着超声时间延长，呈现显著增加的趋势（＜0.05），后又呈显著下降（＜0.05），在40—60 min时，提取率没有显著性变化（＜0.05）（图9）。可能是因为在提取初期，茶皂素在较大的浓度梯度下，容易从细胞内扩散到周围溶剂中，使茶皂素得率显著增加[32]。后期随着时间的延长，乙醇挥发量增加，会引起提取效果下降，此外长时间提取可能会增加茶皂素的水解程度，破坏茶皂素分子结构，从而致使提取率随之降低。因此，超声时间选择20、30和40 min三个水平进行组合试验。

图9 超声时间对茶皂素得率的影响

2.2.6 提取温度茶皂素得率随着提取温度的增加呈现先升高后下降的趋势，提取温度为60℃时得率最高（图10），这可能是由于乙醇受热易挥发，过高的提取温度会使双水相体系中乙醇挥发，降低其提取能力，从而影响茶皂素得率。因此，提取温度选择50℃、60℃、70℃三个水平进行组合试验。

2.3 Plackett-Burman设计试验

以茶皂素得率为考察指标，用Design expert软件对试验数据进行处理，试验结果如表4，各因素的显著性分析如表5，由于模型的＜0.05，可知该模型具有显著性影响，6个因子影响大小排序为超声时间＞乙醇质量分数＞硫酸铵质量分数＞超声功率＞提取温度＞液固比，其中乙醇质量分数、硫酸铵质量分数和超声时间对茶皂素提取具有显著性影响（＜0.05），因此，选用以上3种因素进行响应面设计试验。

图10 提取温度对茶皂素得率的影响

2.4 提取油茶粕茶皂素响应面试验结果分析

2.4.1 响应面试验设计与结果在单因素试验结果的基础上，确定提取温度为60℃，液固比为50﹕1，超声功率为300 W，以乙醇质量分数、盐质量分数、超声时间为自变量，以茶皂素得率为响应值，采用响应面进行三因素三水平的试验设计，共包括17组试验方案，试验结果见表6。

2.4.2 模型建立与方差分析采用Design expert软件，选择Box-Behnken Design模型，对试验设计中各组的茶皂素提取量进行回归分析，得到回归方程如下：

=26.58-0.461-0.382+0.253+1.3812-0.5113+0.1223-1.6212-1.9322-0.7932（6）

式中，：油茶粕茶皂素得率（%）；1：乙醇质量分数（%）；2：硫酸铵质量分数（%）；3：超声时间（min）。

分析发现，该模型值为61.17（＜0.0001），说明所选模型差异极显著。失拟项值为0.7464（＞0.05），失拟项不显著，表明试验结果和该模型拟合度高，该模型能较好地预测茶皂素的提取效果（表7）。由自变量值大小可知，各因素对油茶粕茶皂素得率的影响依次为：1（乙醇质量分数）＞2（硫酸铵质量分数）＞3（超声时间）。由自变量的值可知，因素1、2、12、13、12、22、32差异极显著（＜0.01），3差异显著（＜0.05），其他项差异不显著。

表4 Plackett-Burman试验设计及结果

表5 Plackett-Burman试验方差分析

*表示差异显著（＜0.05） * indicate significant difference (＜0.05)

回归模型的决定系数2=0.9874，调整决定系数2adj=0.9713，说明该模型的拟合程度较好，可以利用该模型对超声辅助双水相提取油茶粕茶皂素进行分析及预测。变异系数为1.16%，表明试验的重复性好，试验结果可靠。综上所述，可以采用该模型的试验结果进行分析，确定超声辅助双水相提取油茶粕茶皂素的最优参数条件。

2.4.3 两因子间交互作用分析图11各图是由响应值和各试验因子构成的立体曲面图，显示乙醇质量分数、硫酸铵质量分数和超声时间中任意两个变量取零水平时，变量对油茶粕茶皂素得率的影响。

图11-a显示茶皂素得率随着硫酸铵质量分数和乙醇质量分数的增大而增大，到达中心点后开始下降。图11-b表明茶皂素得率是随超声时间和乙醇质量分数的增大而增大，达到最大值后开始逐步下降。图11-c表明随着超声时间的增加，茶皂素得率先增加后减小，而硫酸铵质量分数对茶皂素得率的影响也表现为此趋势。从图中等高线密度可以看出，乙醇质量分数的等高线密度最大，而硫酸铵质量分数和超声时间的等高线密度差异不大，表明乙醇质量分数对茶皂素得率的影响最大，其次为硫酸铵质量分数和超声时间。

表6 响应面分析试验设计及结果

表7 回归模型方差分析

*表示差异显著（＜0.05）；**表示差异极显著（＜0.01）

* indicate significant difference (＜0.05); ** indicate extremely significant difference (＜0.01)

图11 乙醇质量分数（x1）、硫酸铵质量分数（x2）和超声时间（x3）对茶皂素得率影响的响应曲面图

2.4.4 最优提取条件的确定与验证利用Design Expert软件优化试验数据，得出超声耦合双水相提取茶皂素的最佳工艺参数为：乙醇质量分数27.485%，硫酸铵质量分数19.636%，超声时间32.323 min，超声功率300 w，提取温度60℃，液固比50﹕1，在此条件下茶皂素的预计得率为26.704%。为了检验上述优化结果，本试验利用优化后的参数进行验证。考虑到实际的可行性和便利性，修正提取工艺为乙醇质量分数为27.50%，硫酸铵质量分数为19.60%，超声时间为32 min，超声功率300 W，提取温度60℃，液固比50﹕1，在此条件下做3次平行试验的茶皂素得率为（26.21±0.54）%，与理论值相比，相对误差为2.47%，说明该模型可以较好地预测UAATPE提取茶皂素的得率，验证了优化提取条件的可靠性。

2.5 不同提取方法的比较

在本试验UAATPE优化条件下进行提取，由表8可知，在提取时间缩短28 min，提取温度降低20℃的情况下，与传统乙醇提取法相比，茶皂素得率无显著性差异（＞0.05），但提取物纯度显著增加（＜0.05），提高了6.57%，此时乙醇质量分数仅为27.50%；相较于传统水提法，茶皂素得率极显著增加（＜0.01），提升了17.74%，同时茶皂素纯度极显著增加（＜0.01），提升了40.23%。

2.6 不同提取方法处理油茶粕微观结构

物质提取效果与植物组织细胞壁的物理变化存在一定关系，且不同提取方法处理下，油茶粕组织结构的物理变化有显著差异。油茶粕组织样品经过粉碎处理后（图12-a），其组织结构表面较为光滑，粉碎处理对样品的破坏程度较小。相较于未经提取处理的油茶粕组织样品，乙醇提取法、UAATPE和水提法处理后（图12-b—d）的油茶粕样品组织结构皆受到不同程度的破坏。水提法处理后的油茶粕粉末表面呈现一定的褶皱，但多为光滑平面，而乙醇提取法处理后的组织样品出现一定松散和空洞，两种处理方式对样品的破坏程度皆较小。然而经UAATPE法处理后，油茶粕组织样品破损程度较为严重，出现了大量孔洞的同时还出现较为严重的表面收缩，这可能是由于超声波的细胞空化效应，加剧了油茶粕组织的破坏[20]，因而促进了油茶粕植物细胞中茶皂素的释放。

表8 不同提取方法比较

不同小写字母表示差异显著（＜0.05） Different lowercase letters indicate significant difference (＜0.05)

a：油茶粕粉碎样品；b：传统乙醇提取法处理后油茶粕样品；c：超声耦合双水相提取法处理后油茶粕样品；d：水提取法处理后油茶粕样品

3 讨论

3.1 双水相体系选择与茶皂素提取效果的相关性

双水相系统是指一种或几种物质以适当质量分数溶解在水相中，在一定条件下形成互不相溶的水溶液体系，如聚合物/聚合物/水、聚合物/无机盐/水、聚合物/有机盐/水、表面活性剂/表面活性剂/水、小分子有机溶剂/无机盐/水等体系[33]。研究表明，ATPS体系对多种生物活性物质具有良好的提取纯化效果，这很大程度上取决于两相体系的选择，而其中以低分子有机溶剂和无机盐组成的双水相体系最为典型。LI等[34]采用双水相提取海棠多糖，评价了5种盐（(NH4)2SO4、KH2PO4、NaH2PO4、Na2HPO4、Na2CO3）与乙醇组成的ATPS体系对海棠多糖的提取效果，5种ATPS体系对多糖提取效果有显著性差异，其中以硫酸铵/乙醇/水体系最优。SHAKER等[35]发现聚合物/盐/水ATPS体系更适合姜黄素的纯化，其中以PEG6000/Na2SO4/水为最佳提取体系。由此可见，双水相体系可就不同天然活性物质的物理性质进行专一性设计。

在采用小分子有机溶剂/无机盐/水ATPS体系提取茶皂素过程中，低分子有机溶剂和无机盐的种类对茶皂素分配系数有重要影响，Ng等[36]研究表明低分子有机溶剂的烷基链短，疏水性较低，有助于物质迁移到富含醇的顶相，提高其分配系数和回收率，进而使提取物得率和纯度提高。而JIANG等[37]研究发现无机盐种类也可影响提取效果，磷酸盐与硫酸盐和柠檬酸盐相比，具有较低的盐析效应，这可促进提取物迁移到富含有机溶剂的顶相。基于此，本研究选定乙醇作为提取体系的低分子有机溶剂，此外根据茶皂素是三萜类皂苷，结构侧链上多为羧基，显酸性的特性[38]，针对性选择强酸弱碱盐(NH4)2SO4及呈现弱碱性的K2HPO4作为分相盐进行体系筛选。根据Hofmeister规律可知，(NH4)2SO4与K2HPO4具有相近的盐析能力[39]，同时本研究关于体系筛选的分析结果也表明，乙醇/(NH4)2SO4及乙醇/K2HPO4对茶皂素的提取效果相近，两者分配系数和回收率都无显著性差异。然而，相较于分配系数和回收率，相比是评价提取体系是否适当的关键指标[37]。结合本研究关于双水相相图和体系筛选研究结果与辜鹏[40]对分相时间的研究可知，乙醇/(NH4)2SO4体系分相范围更广，分相能力更强且相比适中，更加适用于茶皂素提取。综上，本研究在缩短提取时间和降低有机溶剂使用量的情况下，UAATPE法显示出良好的提取效果，其显著提升了提取物茶皂素得率和纯度。

3.2 UAATPE法对油茶粕茶皂素提取过程的影响

超声波是一种在传播过程中形成交替正压和负压的高频弹性波，油茶粕植物细胞中的空化气泡在超声波频率带动下达到共振，产生空化气泡的膨胀破裂，当到达极限爆裂时，气泡内将产生极高温度和压强，造成油茶粕细胞组织结构瞬间破坏，加速细胞内容物向溶剂的扩散速度[41]。如提取示意图（图13）显示，UAATPE法提取茶皂素是一个动态的复杂过程，相较于传统提取法，油茶粕样品位于富含盐的底相和富含醇的顶相之间，UAATPE法提取茶皂素经历了两个阶段，第一阶段：在超声波引起的强烈空穴效应和热效应下，油茶粕细胞组织瞬间破坏，植物细胞内容物快速扩散至具有高电导率的含盐底相，加速茶皂素等成分与油茶粕基质分离。本研究中UAATPE法提取后的油茶粕扫描电子显微镜图也显示，超声波可使油茶粕产生大量空洞，同时对比传统乙醇提取法可知超声波作用显著提升了茶皂素提取效率。UAATPE法提取前期主要以固液提取为主，茶皂素不断富集到底相，同时在机械与空化效应提供的搅拌作用下，双水相顶相与底相充分接触，促进了茶皂素在底相与顶相之间的液液萃取。第二阶段：体系主要进行的是茶皂素在富含盐的底相和富含有机溶剂的顶相之间的选择性分配，分配规律服从能斯特分配定律，该过程以液液萃取为主。本研究中体系筛选时茶皂素回收率高达80%以上，这表明ATPS体系实现了对茶皂素与杂质的两相选择性分配，使茶皂素在上相富集，而进一步与传统水提法的比较则证明正是这种选择性分配使茶皂素纯度显著上升。双水相体系对茶皂素的选择性分配是因为茶皂素是一类五环三萜类皂苷，水溶液呈弱酸性，茶皂素分子结构中含有羧基、羟基、羰基等，从酸碱平衡的角度可以把茶皂素看做二元弱酸，同时根据双水相萃取的相似相溶原理，在此过程中茶皂素将优先分配到极性较小的富含有机溶剂的顶相。此外，这种选择性分配还受到多种作用力（分子间作用力、静电力、分子空间阻碍力等）的影响，茶皂素在双水相体系中分配系数如下式所示：=a+b+c，式中：a为氢键作用力，b为静电力，c为其他作用力[33]。

本研究结果显示，在超声波作用下，油茶粕微观结构出现大量空洞和严重表面收缩，促进油茶粕植物细胞内茶皂素释放，提高其得率，同时双水相体系可使茶皂素与杂质在两相内进行选择性分配，进而提升茶皂素纯度；此外，UAATPE法提取时，茶皂素先是经过固液提取从油茶粕中进入底相，然后经液液萃取迁移至顶相，使茶皂素在含有机溶剂的顶相富集，而低聚糖、小分子多糖及有机酸等水溶性杂质则在水相富集，进而提升顶相茶皂素纯度，达到初级纯化的效果。

图13 UAATPE法茶皂素动态提取过程示意图

4 结论

采用Plackett-Burman和Box-Behnken试验设计优化得到超声耦合乙醇/硫酸铵双水相体系提取油茶粕茶皂素的最佳提取工艺条件为：乙醇质量分数为27.50%，硫酸铵质量分数为19.60%，超声时间为32 min，超声功率300 W，提取温度60℃，液固比50﹕1，提取物茶皂素的得率为（26.21±0.54）%，纯度为（66.09±0.04）%。超声波耦合双水相提取作为一种低成本且高效率的新型技术，可为农产品加工副产物中生物活性成分的提取提供新思路。

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Optimization and Mechanism of Ultrasonic-Assisted Two-Phase Extraction of Tea Saponin

1Sericultural & Agri-Food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Functional Foods, Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing, Guangzhou 510610;2College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640;3Guangdong Xinghui Biological Technology Co., Ltd., Longchuan 517323, Guangdong

【】Tea saponin is a naturally active substance with wide application prospective, and its purity is the key factor limiting its application and value. In this study, the optimal conditions for ultrasonic-assisted two-phase extraction (UAATPE) of tea saponin from camellia meal were explored, and the possible extraction mechanism was discussed in order to develop an efficient, high-purity extraction technology, so as to provide a technical guidance for high-value utilization of camellia meal. 【】On the basis of the single factor experimental results, the key factors affecting the yield of tea saponin were screened by Plackett Burman design, and the extraction process was optimized by Box-Behnken design. The extraction efficiency of tea saponin using the UAATPE method was evaluated by comparing the extraction yield and purity to the traditional ethanol extraction method and water extraction method. Scanning electron microscopy (SEM) was employed to analyze the microstructure of camellia meal, and the possible mechanism of extraction by the UAATPE method was discussed. 【】The key factors affecting the yield of tea saponin were mass fraction of ethanol, mass fraction of ammonium sulfate, and ultrasonic time. The process parameters optimized by Box-Behnken design were as follows: an ethanol content of 27.50% (W/W), an ammonium sulfate content of 19.60% (W/W), a liquid-solid ratio of 50﹕1, an ultrasonic time of 32 min, an ultrasonic power of 300 W and an extraction temperature of 60℃, and the yield of tea saponin at (26.21±0.54)% was achieved under the optimized conditions. Compared with the traditional method of ethanol extraction, the purity of tea saponin extracted by the UAATPE method increased by 6.57% (＜0.05), although the difference of the yield of tea saponin extracted by these two methods was not significant. Compared with the traditional method of water extraction, the yield and purity of tea saponin extracted using the UAATPE method were increased by 17.74% and 40.23%, respectively (＜0.01). The microstructure showed that owing to the effect of the camellia meal treated by the UAATPE method, the ultrasonic cavitation accelerated the tissue damage of the camellia meal, producing a large number of voids and strong surface shrinkage, which effectively promoted the release of tea saponin in the camellia meal. In the process of the UAATPE extraction, the tea saponin first entered the bottom phase with high electrical conductivity through solid-liquid extraction in the two-phase water system, and then moved to the top phase with high polarity through liquid-liquid extraction, achieving primary purification and improving the purity of tea saponin. 【】The UAATPE method could significantly improve the yield and purity of tea saponin, thus providing a new novel method for the efficient utilization of camellia meal.

camellia meal; tea saponin; ultrasound; aqueous two-phase extraction; Plackett-Burman; response surface design