SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风风证显著关联

古 联，黄先利，严 雁，杨怡冰，唐略钧，苏 莉

（1. 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2. 广西中医药大学，广西 南宁 530001；3. 广西医科大学公共卫生学院，广西 南宁 530021）

缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS），归属传统医学“中风”范畴，又可名为缺血性中风。证候是对疾病发展某一阶段的病因病机的总体概括，同一疾病在发展的不同阶段存在不同的病理状态，则表现出不同的证候，即“同病异证”。古代医家朱丹溪在其著作《丹溪心法》中提出“有诸内者必形诸外”，同一疾病出现不同的证候，其内在必定存在着与该病理表现相应的一些物质基础。既往多项研究结果表明，基因多态性与证候具有关联性，基因多态性可作为证候的客观生物标志［1-3］。小核RNA 激活复合体多肽3（SNAPC3）位于染色体9p22.3 上，也被称为SNAP50。SNAP50锌指结构域在启动子识别和人类的小核RNA 基因转录中具有重要作用［4］。目前较少有关SNAPC3基因多态性与缺血性中风关系的研究报道。本研究旨在探寻SNAPC3基因rs12093 位点多态性与缺血性中风及其中医证候的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 纳入标准 病例组：所有纳入研究对象符合西医诊断标准同时符合中医诊断标准。西医诊断标准需要与1995 年中华医学会第四次全国脑血管病学术会议修订的《各类脑血管疾病诊断要点》中缺血性脑卒中诊断标准相符合，所有纳入研究对象通过头颅计算机断层扫描（CT）和/或磁共振成像（MRI）医学成像技术检查，以获取诊断明确的结果。中医诊断标准同样需要与国家中医药管理局1996 年制订的《中风病辨证诊断标准（试行）》中的中风病诊断标准相符合。对照组：所有纳入研究对象性别、年龄需与病例组相匹配。

1.1.2 排除标准 病例组：由其他因素如脑外伤、脑血管畸形、动脉炎、肿瘤、短暂性缺血发作（TIA）、感染、药物等引起的缺血性脑卒中患者；合并有严重感染性疾病或自身免疫系统疾病患者；合并有严重心脏、肝脏、肾脏功能不全及造血功能障碍患者。对照组：患有心脏、肝脏、肾脏功能障碍患者以及自身免疫系统疾病患者。

本研究中所有研究对象自我报告为中国汉族人群，且相互之间不存在亲缘关系。本研究方案已提交至广西医科大学医学伦理委员会审核，获得批准后开始进行研究。在知情同意的原则下，已详细告知研究对象本研究项目的流程及目的。本研究所有纳入研究对象已充分了解本研究内容并表达同意后，签署知情同意书。

1.2 中医辨证分型

依照《中风病辨证诊断标准（试行）》的中风病辨证分型标准，可将本研究的中风病中医证候分为6 个证型，具体证型为风证、火热证、痰证、血瘀证、气虚证、阴虚阳亢证。采用该标准，在缺血性中风患者起病7 d 内对其进行中医证候评分。将对中风证候诊断具有高特异性、高敏感性的症状和体征纳入评分项内容中。赋分依据为其对证候诊断所占的比重，将各评分最高分相加所得总分即为相应证候所得分，每个证候≥7 分则表示该证候诊断成立。每位缺血性中风患者，均经由2 名中医医师严格参照该标准进行评分后方可确立其中风证候。若存在上述两位中医医师证候评分结果不一致的情况，则由第3 位具有副主任医师以上职称的中医医师进行中医证候评分并最终确定其证候。

1.3 一般资料

本研究纳入研究对象共计1 567 例，其中病例组纳入774 例缺血性中风患者，对照组纳入793 例健康对照。病例组研究对象均来自广西中医药大学第一附属医院脑病科住院部收治的缺血性中风患者。对照组研究对象均来自同期该医院体检中心的健康体检者或骨科等病势轻微的外伤患者。病例组与对照组平均年龄分别为（64.12±10.34）、（63.81±10.36）岁。病例组与对照组的研究对象在性别（χ2＝2.815，P＝0.093）、年龄（t＝-0.582，P＝0.561）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。根据上述采用的中医中风病辨证分型标准，本研究病例组缺血性中风患者均确立证型，包括痰证、风证、血瘀证、气虚证、火热证及阴虚阳亢证。

1.4 方法

在所有纳入研究对象清晨空腹状态下，使用EDTA 抗凝管 采集其2 mL 的外周静脉血。采用北京艾德莱生物科技有限公司（Aidlab biotechnologies Co. Ltd）的全血基因组DNA 提取试剂盒并严格按照其操作说明书，对采集血样进行血液基因组DNA 提取。光密度（OD）值的检测采用Nano-Drop2000 仪器进行，1.25%琼脂糖凝胶电泳检测，DNA 质检合格后转置于-80 ℃低温冰箱冻存备用。采用北京博淼生物科技有限公司的Agena 平台中的MassARRAY SNP 基因分型实验技术进行基因分型检测。

1.5 临床指标检测

所有参与者空腹状态下于清晨采集2 mL 抗凝血。使用迈瑞6900 全自动血细胞分析仪检测全血中血小板的水平。 活化部分凝血活酶时间（APTT）、国际标准化比值（INR）、D-二聚体（DD）、纤维蛋白原（FIB）、凝血酶时间（TT）、凝血酶原时间（PT）、凝血酶原时间活性（PTA）等凝血功能指标运用STAGO 全自动抗凝血凝血仪进行测定。

1.6 统计学处理

遗传关联分析采用PLINK 软件进行。应用拟合优度卡方检验进行哈温平衡（Hardy-Weinberg Equilibrium，HWE）检验。采用SPSS16.0 软件进行统计分析，正态分布的计量资料组间比较采用t检验，计数资料组间比较采用卡方检验。rs12093 多态性与缺血性中风及其证候发生风险的关联性结果通过运用非条件多因素Logistic 回归模型进行分析获得，采用分析所得结果的比值比（OR）及其95%置信区间（CI）以表示关联强度。应用一般线性回归分析rs12093 位点多态性与缺血性中风患者数量性状之间的相关性。本研究所有统计学的检验方法为双侧检验，检验水准为α＝0.05。

2 结果

2.1 SNAPC3 基因rs12093 多态性位点的哈温平衡检验及基因型频率分布比较

拟合优度卡方检验结果显示，对照组的SNAPC3基因rs12093 的基因型频率分布符合哈温平衡（PHWE＝0.779）。经卡方检验后，结果显示rs12093 位点的基因型频率在中风病例组与对照组中的分布差异无统计学意义（P＝0.268）。中风风证、火热证、痰证、血瘀证、气虚证各证候组与对照组之间的rs12093 基因型频率分布差异也均无统计学意义（各证型P均＞0.05）。由于本研究收集的阴虚阳亢证样本例数过少，故未对阴虚阳亢证型进行后续研究分析。

2.2 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风的关联分析

在4 个遗传模型中：SNAPC3基因rs12093 多态性与缺血性中风的发生风险均无显著关联（各遗传模型P均＞0.05）；校正年龄、性别后，仍无显著关联（各遗传模型P均＞0.05）。见表1。

表1 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风易感性的关联分析Tab 1 Association analysis between rs12093 polymorphism of SNAPC3 gene and susceptibility to ischemic stroke

2.3 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风中医证候的关联分析

多因素Logistic 回归模型分析结果显示，rs12093 位点多态性与缺血性中风风证发生风险显著关联，在校正性别、年龄后，rs12093 与缺血性中风风证发生风险的关联，仍具有统计学意义。此外，在校正年龄、性别前后，均未发现rs12093 多态性与缺血性中风火热证、痰证、血瘀证、气虚证的发生风险显著相关（P均＞0.05），见表2。

表2 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风中医证候的关联分析Tab 2 Association analysis between rs12093 polymorphism of SNAPC3 gene and TCM syndrome of ischemic stroke

2.4 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风中医证候评分的关联分析

一般线性模型分析结果显示，SNAPC3基因rs12093 多态性与缺血性中风风证评分显著关联［加性模型：β＝-0.51，95%CI（-0.98～-0.03），P＝0.037）；隐性模型：β＝-1.48，95%CI（-2.61～-0.36），P＝0.010）］，在校正性别、年龄后这种关联性仍存在统计学意义［加性模型：βadj＝-0.51，95%CIadj（-0.98～-0.03），Padj＝0.037；隐 性 模 型：βadj＝-1.49，95%CIadj（-2.61～-0.37），Padj＝0.009］。此外，在校正年龄、性别前后，均未发现rs12093 多态性与缺血性中风火热证、痰证、血瘀证、气虚证的评分显著相关（P均＞0.05），见表3。

表3 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风中医证候评分的关联分析Tab 3 Correlation analysis between rs12093 polymorphism of SNAPC3 gene and TCM syndrome score of ischemic stroke

2.5 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风风证患者凝血及血小板水平的相关分析

一般线性模型分析结果显示，rs12093 与缺血性中风风证患者血小板水平［加性模型：β＝-16.29，95%CI（-30.44～-2.15），P＝0.025）；显性模型：β＝-18.10，95%CI（-35.49～-0.71），P＝0.042）］、凝血酶时间水平［显性模型：β＝-0.51，95%CI（-1.00～-0.03），P＝0.039）］显著关联，校正性别、年龄后，rs12093 与缺血性中风风证患者血小板水平［加 性 模 型：βadj＝-16.30，95%CIadj（-30.36～-2.24），Padj＝0.024；显性模型：βadj＝-18.26，95%CIadj（-35.55～-0.98），Padj＝0.039］、凝血酶时间水平［显性模型：βadj＝-0.50，95%CIadj（-0.99～-0.02），Padj＝0.042］，关联性仍具有统计学意义，见表4。

表4 SNAPC3 基因rs12093 多态性与缺血性中风患者凝血相关指标的关联分析Tab 4 Association between rs12093 polymorphism of SNAPC3 gene and coagulation related indexes in patients with ischemic stroke

3 讨论

基因组学的研究范围是整个基因组层面，主要是对基因的位置、结构、基因产物功能和基因之间的联系进行研究。运用基因组学的方法技术可以筛选出与疾病发生发展过程相关的易感基因，这对临床上预防和治疗疾病有重要的指导意义。单核苷 酸 多 态 性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）是基因组学主要的研究方法技术之一，同时也是目前研究复杂性疾病的重要方法。近年来，运用SNPs 检测技术的研究方法，发现了多个缺血性中风易感基因位点。其中在染色体9p21.3 基因座上已经有研究证实存在与缺血性脑卒中、心血管疾病、糖尿病等疾病相关的易感位点［5］。

多项研究结果显示在染色体9p21 区域上的多个位点（rs1333047-TT 型、rs1537378、rs10757278、rs2383206）与缺血性中风发生风险相关联［6-8］。这提示染色体9p 区域里可能存在不少缺血性中风的易感位点。SNAPC3又称SNAP50，位于染色体9p22.3，目前尚未见有SNAPC3基因多态性与缺血性脑卒中的关联研究的报道。但有学者在日本人群全基因组关联研究中，发现SNAPC3附近的基因SYK（9q22.2）与房颤的发生相关［9］，而房颤可诱发脑卒中的发生。更有研究结果证实SYKrs2290890 T 等位基因频率、SYK基因rs2306040（T/C）多态性均与缺血性脑中风发生风险相关联［10，11］。这些结果提示位于9p22.3 的SNAPC3基因可能与缺血性脑卒中发生风险相关。 因此本研究对基因SNAPC3与缺血性中风之间的关系进行探索研究，结果显示SNAPC3基因rs12093 多态性与缺血性中风发生风险无关联，但该位点与缺血性中风风证发生风险及其风证评分显著关联。

中风基本病机可概括为“火、痰、风、虚、气、血”六端，其中“风”有“外风”与“内风”之分。如隋唐之前所倡导的外风说，便从“内虚邪中”立论，认为中风是人体在气血虚损，卫气不固等较为虚弱的状态下，外受风邪侵袭，内有脏腑失和所致。唐之后的“内风”致病说，则认为中风并不是由外来风邪所导致，而是人体内生风、动风所致，属于本气自病［12］。李水芹等［13］通过对急性缺血性中风患者证候的研究，结果显示在中风患者证候分布中，风证最为多见。由此可见，“风”是中风病致病主要证候要素之一。中医证候是对疾病发展至某一阶段机体生理病理状态变化的概括，而发病的季节、地区以及个人体质的不同对疾病的发展具有重要的影响，则同一疾病发展的不同阶段所表现的症状、体征、病理变化亦不尽相同，即“同病异证”。个体之间的差异与基因多态性有密切的关联，可通过对疾病与基因多态性的探究，探寻与证候形成相关的基因位点，以揭示证候的本质，为中医证候及同病异证提供分子生物学依据。目前，已有研究发现中医同病异证具有内在的生物分子依据。如龙春莉等［14］发现Megsin基因C2093T 基因型频率与IgA 肾病脾肾气虚证相关联（P＜0.05），而与气阴两虚证、肝肾阴虚证和风湿热毒证比较差异均无统计学意义；严新等［15］发 现IL-1B-31TT 型 基 因 多 态 性、IL-10-1082AG 型基因多态性与胃癌前疾病脾胃湿热证发生风险有关，而与肝胃不和证、脾胃虚弱证发生风险无关；IL-8-25AA 基因多态性与胃癌前疾病肝胃不和证和脾胃虚弱证发生风险显著相关，而与脾胃湿热证发生风险无关。另有研究发现TBX21基因rs11657479 多态性与缺血性中风火热证的发生风险显著相关，但未发现该位点多态性与风证、痰证、血瘀证、气虚证的发生具有相关性［16］。这些研究结果表明，通过基因位点多态性的检测手段寻找中医证候内在分子生物依据具有可行性，同时可为中医同病异证提供理论支持。本研究发现SNAPC3基因rs12093 多态性与缺血性中风风证发生风险及其风证评分显著关联，这表明SNAPC3基因rs12093 多态性可能是缺血性中风风证发生风险并区别于其他中医证候的分子遗传学基础之一。

此外，本研究还发现SNAPC3rs12093 多态性与缺血性脑卒中风证患者血小板、凝血酶时间相关。血小板和凝血系统激活经过体内的各种生理病理反应促使了体内血栓的形成［17］。血栓形成后导致血管腔变狭窄，血管堵塞引起脑卒中。沈明强等［18］研究发现GPIa C807T 等位基因型与脑卒中急性期患者血小板功能增强相关联；徐秀芝等［19］研究发现βFg-455G/A 多态性频率对急性脑梗死患者的血小板聚集率有一定的影响作用。另有研究表明CALM1基因rs3179089 多态性与缺血性中风患者凝血酶时间显著相关［20］。这表明基因多态性对缺血性中风患者的凝血功能存在影响作用。这提示SNAPC3基因rs12093 多态性可能影响着缺血性中风风证患者的凝血功能，但其的潜在机制仍需进一步研究探讨。

SNAPC3基因rs12093 多态性可能与缺血性中风风证的发生发展相关，但不与缺血性中风其它中医证候的发生相关，可能是缺血性中风风证的分子遗传学基础，为“同病异证”中医理论提供了支持。

作者贡献度说明：

古联：安排实验研究工作，收集病例样本，文章写作；黄先利：进行实验、数据统计分析；严雁：临床样本采集及资料收集；杨怡冰：数据录入；唐略钧：进行实验；苏莉：实验研究工作统筹安排。