车车前前草草醇醇提提取取液液对对海海鱼鱼腐腐败败细细菌菌的的抑制作用

◇海南热带海洋学院水产与生命学院 陈达宏 唐秀琴 马红梅

随着生活条件越来越好，海鱼逐渐成为人类餐桌上必不可少的食物。但是捕捞后的海产品在运输路程中和储藏期间容易出现易氧化和细菌的快速繁殖，从而导致鱼肉变质和腐败。本文研究车前草提取物对九种海鱼表体常见细菌的抑制作用，实验结果表明：车前草80%醇提取液可以有效抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和普通变形杆菌的生长繁殖，为车前草制成海鱼的环保食用保鲜剂提供了理论依据。

随着生活条件越来越好，海鱼逐渐成为人类餐桌上必不可少的食物。但是捕捞后的海产品在运输路程中和储藏期间容易出现易氧化和细菌的快速繁殖，从而导致鱼肉变质和腐败。本文研究车前草提取物对九种海鱼表体常见细菌的抑制作用，实验结果表明：车前草80%醇提取液可以有效抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和普通变形杆菌的生长繁殖，为车前草制成海鱼的环保食用保鲜剂提供了理论依据。

车前草（学名：Plantago asiatica L.），为车前科车前属，别名车轮菜、当道、凤眼车前等，二年生或多年生植物[1]，中国多省份均能适宜生长。车前草适应能力极强，对土壤要求不严格，常见于草地，河岸边，路旁两道或田野山间等，在20℃～30℃的温度范围内其茎叶均能正常生长，温度在32℃以上的时候生长速度则明显减缓，甚至枯萎直至死亡[2]。目前，我国仅产车前属Plantago，约18种，在世界范围内证明是车前科的有3属，约270种[3]。迄今为止，车前草已被分离出60余种化合物，如多糖类、黄酮及其苷类、三萜及甾体类和挥发油类等[4]。车前草最开始记载于《神农本草经》，被列为药草中的上品，全草和种子均可药用[5]，具有抑菌抗氧化、清热明目、燥湿止泻、凉血止血和退热止痛的功效[6]。

海鱼营养丰富，也是微生物生长繁殖的良好的基质。冯敬宾等研究表明海水鱼类的皮肤、肠道和鳃的表面上细菌组成中常见优势菌属多为假单胞菌、杆菌、弧菌、球菌和无色菌[7]，因此抑制此类菌的生长是海鱼保鲜的首要考虑。因化学保鲜剂有毒副作用，低温保藏需制冰增加运输成本，因此生物保鲜成为研究的热点。生物保鲜技术具有便捷高效、健康安全、天然无害、毒副作用小或无毒副的保鲜作用等优势，因此，生物保鲜剂代替化学保鲜剂不仅可以延长海鱼的保质期，更加保障了食品的安全[8]。本实验研究车前草不同醇提取液对九种常见鱼体上的细菌的抑菌效果，为车前草制成植物保鲜剂，减少细菌对鱼体的污染，延长海鱼的保鲜时间提供有效依据。

1 实验材料与方法

1.1 实验材料

（1）实验材料。车前草干草（Plantago asiatica L.）从海南省三亚市荔枝沟市场购买，符合《中国药典》2015年版，产地江西。

（2）菌种。副溶血性弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、荧光假单胞菌（P.Fluorescens）、腐败希瓦氏菌（Shewanellaputre faciens）、无色杆菌属（Achromobacter sp）、大肠埃希氏菌（E.coli）、沙门氏伤寒杆菌（Salmonella enteric）、金黄色葡萄球菌（S.aureus）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、普通变形杆菌（Proteusvulgaris），实验菌种均购买于广东省环凯微生物科技有限公司。

（3）菌种活化。用营养琼脂制成斜面，将复苏液或无菌水加入菌粉中，摇匀后用移液枪吸取液体接种菌种到配制好的斜面中，于37±2℃培养，复苏后的菌种宜传代培养2～3次。将活化好的菌种保存在0～4℃的冰箱中。

1.2 实验方法

（1）车前草提取液的制备。用电子天平秤取400g烘干后的车前草分装，分别加入无水乙醇、90%乙醇和80%乙醇溶液各1000mL并浸泡12h，滤液用旋转蒸发器在60℃条件下旋转蒸发，直至乙醇或水完全被蒸发后，用超纯水洗出提取物配制成1g/mL溶液备用，再用超纯水配出0.75g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL的样液[9]。

（2）抑菌活性的测定。采用K-B纸片扩散法药敏试验法测定[10]：用打孔器在滤纸上剪取6mm的圆形纸片。将车前草醇提取液样液浸泡无菌纸片1h，挥干即用。用比浊法配成菌悬液为1×106～1×107c fu[11]，用移液枪吸取0.2mL供试菌悬液注入到固体培养基表面，用涂布器涂匀，每个样品对每种测试菌做三个重复。在恒温培养箱37℃中培养36h后，观察抑菌圈大小并用游标卡尺采用十字交叉法测量抑菌圈直径（包括纸片的6mm），取几何平均值[12]。用统计学软件SPSS17.0版处理数据。

2 车前草醇提取液的抑菌作用

2.1 车前草无水乙醇提取液的抑菌作用

由表1可知，车前草无水乙醇提取液在设为不同浓度的情况下，对同一种细菌都有极显著的抑制作用（P<0.01）。当浓度为0.25g/mL时，仅对沙门氏伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌有低抑制作用。当浓度为0.50g/mL时，对副溶血性弧菌、荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、沙门氏伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果显著提高。当浓度为0.75g/mL时，抑制均有效果且达到最大，其中对腐败希瓦氏菌、无色杆菌属、金黄色葡萄球菌和普通变形杆菌均达到中抑菌水平，抑菌圈的直径略大于10mm，相对于沙门氏伤寒杆菌和荧光假单胞菌有非常显著的差异性。总体来说此提取液对沙门氏伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌抑制效果较好。

表1 车前草无水乙醇提取液提取液抑菌圈的大小

2.2 车前草90%乙醇提取液的抑菌作用

由表2可知，车前草90%乙醇提取液在设为不同浓度的情况下，对同一种细菌都有极显著的抑制作用（P<0.01）。当浓度为0.25g/mL时，仅对金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和粪肠球菌有抑制效果且作用强烈。当浓度为0.50g/mL时，对副溶血性弧菌、腐败希瓦氏菌、沙门氏伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和普通变形杆菌抑制效果显著提升，其中粪肠球菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈大小已达到17mm以上。当浓度为0.75g/mL时，抑制均有效果且达到最大，腐败希瓦氏菌、沙门氏伤寒杆菌和普通变形菌的抑菌圈在10～15mm之间，有中抑菌活性；粪肠球菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈竟高达19mm以上，有高抑菌活性，且对无色杆菌属、荧光假单胞菌和副溶血性弧菌的差异最显著。总体来说此提取液对金黄色葡萄球菌和粪肠球菌抑制效果非常强烈。

表2 车前草90%乙醇提取液的抑菌作用

2.3 车前草80%乙醇提取液的抑菌作用

由表3可知，车前草80%乙醇提取液在设为不同浓度的情况下，对同一种细菌都有极显著的抑制作用（P<0.01）。当浓度为0.25g/mL时，对九种细菌均表现出抑制效果，大肠埃希氏菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌抑制作用高于其他六种菌。当浓度为0.50g/mL时，随着浓度提高，对九种细菌的抑制效果也随之上升。当浓度为0.75g/mL时，抑制效果达到最大，对腐败希瓦氏菌、沙门氏伤寒杆菌和金黄色葡萄球菌有中等抑菌活性，抑菌圈大小在10～15mm之间；对大肠埃希氏菌和粪肠球菌有高抑菌活性，抑菌圈大小在17mm以上，对无色杆菌属、副溶血性弧菌和荧光假单胞菌的差异最显著。总体来说此提取物对大肠埃希氏菌和金黄色葡萄球菌抑制效果非常强烈。

表3 不同浓度车前草80%乙醇提取液抑菌圈的大小

2.4 车前草不同浓度醇提取液对不同细菌作用的菌落数比较

由表4可以得知醇提取液对九个菌株总体来说有不同程度的抑制效果，而且随着浓度的提高抑菌效果也随着增强。当浓度≥0.75g/mL时，三种醇提取液均对九种菌有抑制效果。其中，无水乙醇对金黄色葡萄球菌抑菌效果比较好；90%车前草醇提取液对沙门氏伤寒杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌和粪肠球菌表现强抑制作用；80%车前草醇提取液对腐败希瓦氏菌、大肠埃希氏菌、沙门氏伤寒杆菌、粪肠球菌和金黄色葡萄球菌抑菌效果强烈。当浓度≥0.50g/mL和≥0.25g/mL时，只有80%车前草醇提取液对九种菌都有抑制效果，而90%车前草醇提取液和无水乙醇提取液仅对几种菌能有抑制作用。

表4 车前草不同浓度醇提取液对不同细菌作用的菌落数比较

3 结论

车前草的四种提取液对九种菌都有不同的抑制作用。车前草醇提取液对实验细菌菌株均有不同程度的抑制作用，80%车前草醇提取液>90%车前草乙醇提取液>无水乙醇提取液，这与孔阳研究车前草的不同浓度乙醇提取液具有较强的抑菌效果相似[13]。柴明艳研究车前草的内生菌的活性产物得出对金黄色葡萄球菌、粪链球菌、大肠杆菌、沙门氏菌等的抑菌效果不错[14]，此与实验中得出的四种提取液对大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和普通变形杆菌的抑制效果好的结论相似。经研究表明鱼类身体自带的致病菌主要有假单胞菌属、无色菌属、弧菌和球菌等；在运输过程中还会污染有大肠杆菌、变形杆菌、希瓦氏菌等腐败细菌[15]，由此推断，车前草提取液可以有效抑制大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和普通变形杆菌在海鱼上的生长繁殖，但其对副溶血性弧菌、荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌、无色杆菌属和沙门氏伤寒杆菌的抑制效果不强，因此车前草可以与其它中草药配伍进行强化杀菌。综合车前草的杀菌作用得出，车前草提取物对海鱼运输中污染细菌的生长与繁殖有一定的抑制效果，可以延长捕捞后的海鱼的保质期。