诱导性支气管相关淋巴组织（iBALT）相关细胞因子CXCL13在AECOPD患者肺泡灌洗液中的变化及临床意义①

蔡星璇 林娇娇 李年珍 岳雅丽 杜新 贾俊青

（山西医科大学附属汾阳医院呼吸与危重症医学科，汾阳 032200）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmo‑nary disease，COPD）是一种以气流受限为特征，可预防、可治疗的慢性气道炎症性疾病，是全球三大死亡原因之一［1］。慢性阻塞性肺疾病急性加重期（acute exacerbation of chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD）是指COPD患者症状突然加重，甚至引发呼吸衰竭，是COPD病死率提高的主要原因。细菌定植则是AECOPD发病的主要诱因之一［1-2］。IL-6、IL-8和TNF-α属于促炎因子，在急性炎症早期显著升高［3］。越来越多研究证实，COPD患者体内可检测到低浓度IL-8、IL-6和TNF-α表达，且上述促炎因子在AECOPD患者中显著升高［4-6］。表明炎症反应在COPD发生及发展过程中至关重要。诱导性支气管相关淋巴组织（inducible bronchus-associated lymphoid tissue，iBALT），即不同类型抗原刺激后，患者支气管、肺血管旁以及肺实质中会产生以B细胞为主的淋巴滤泡，此外，还会产生T细胞、树突状细胞、滤泡树突状细胞等，共同组成异位淋巴组织，见图1［7-10］。CXCL13可表达于B细胞、T细胞及滤泡树突状细胞表面，是诱导形成iBALT的重要分子［11-12］。研究发现，COPD小鼠模型中，中和CXCL13会破坏支气管周围和肺实质中已形成的淋巴滤泡［13］。因此，CXCL13参与iBALT形成以及结构的长期维持，且可作为反映iBALT发生及发展的指标之一［8，12-13］。

图1 香烟烟雾暴露小鼠模型和COPD患者肺组织中iBALT病理学表现［8，10］Fig.1 Histopathology of iBALT in chronic cigarette smoke exposed to mice and lung tissues of patients with COPD［8，10］

急性细菌性肺炎患者IL-8、IL-6和TNF-α等促炎因子被激活，进一步诱导M1型巨噬细胞激活［9］。M1型巨噬细胞具有强大的细胞毒功能，可介导机体免疫细胞抑制促炎因子，有利于抵抗细菌感染［14］。COPD稳定期患者IL-10等抑炎因子抑制炎症激活，但会引起MMP12（matrix metalloproteinase 12，MMP12）上调［8］。MMP12是M2型巨噬细胞极化的标志物，与肺气肿相关［15］。研究发现，参与极化的M1型巨噬细胞和M2型巨噬细胞可促进iBALT形成［8-9］。综上所述，急性炎症期，iBALT启动肺部保护性免疫反应，慢性炎症期主要加剧肺部疾病恶化［8-9，13，16］。但iBALT对慢性炎症性疾病伴有急性感染的作用机制尚未明确，因此，本文拟分析iBALT相关细胞因子CXCL13在AECOPD患者支气管肺泡灌洗液（bron‑choalveolar lavage fluid，BALF）中的变化及临床意义，初步探讨iBALT在AECOPD中的作用，明确iBALT在AECOPD治疗中的价值。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象选取2019年11月至2020年11月山西医科大学附属汾阳医院呼吸与危重症医学科收治住院因细菌感染导致COPD急性发作的患者14例（AECOPD组），并选取同期急性细菌性肺炎患者24例（单纯感染组）。所有研究对象按照中华医学会呼吸病学分会《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版）》采集BALF［17］。纳 入 标 准：①AECOPD组 患 者 均 符 合《2021 GOLD慢性阻塞性肺疾病全球倡议：COPD诊断、治疗与预防全球策略》的诊断标准［1］；②所有患者均通过影像学及实验室检测，包括降钙素原（procalcitonin，PCT）、白细胞（white blood cell，WBC）、中性粒细胞（neutrophil，NEU）或痰培养确认肺部存在细菌学感染证据。排除标准：①特殊菌群感染（结核、真菌）所致肺炎；②支原体、衣原体、病毒感染所致肺炎；③伴有心、肝、脾、肾等严重疾病者；④严重营养不良者；⑤自身免疫系统疾病者；⑥恶性肿瘤疾病者；⑦合并严重全身性疾病者；⑧存在精神障碍无法配合检查者；⑨1周内有大咯血和不能耐受支气管镜检查者。本研究经山西医科大学附属汾阳医院临床伦理委员会批准，所有患者及家属知情同意。

1.1.2 主要仪器与试剂纤维支气管镜（日本富士公司）；2700全自动生化分析（日本奥林巴斯）；移液枪（德国Eppenbof公司）；低速离心机（B320型，长沙湘仪离心仪器有限公司）；流式管（美国Falcon公司）；显微镜（日本Nikon）；CXCL13、IL-8、IL-6及TNF-α ELISA试剂盒（联科生物公司）。

1.2 方法

1.2.1 血清降钙素原、白细胞及中性粒细胞水平检测采集患者入院后空腹8 h肘静脉血5 ml，电化学发光分析仪检测血清PCT、WBC及NEU水平。

1.2.2 BALF采集所有研究对象按照中华医学会呼吸病学分会制定的《肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识（2017年版）》进行支气管肺泡灌洗［17］。采集AECOPD组及单纯感染组患者BALF，根据肺部CT表现及纤维支气管镜下表现，选取存在感染表现的肺段作为灌洗部位，灌洗的肺段经活检孔注入1~2 ml 2%利多卡因进行局部麻醉。楔入纤维支气管镜，经活检孔通过硅胶管快速分次注入37℃灭菌生理盐水（约100 ml，20~30 ml/次），立即用100 mmHg负压吸引回收灌洗液，回收率>40%入组，立即用无菌纱布过滤回收的灌洗液，离心（4℃、1 200 r/min、10 min），收集上清，-80℃储存待测。

1.2.3 BALF中细胞因子检测采用ELISA试剂盒测定BALF上清中CXCL13、TNF-α、IL-6和IL-8水平，严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理采用SPSS26.0软件进行统计学分析，Graphad Prism 8和Photoshop软件作图。Shapiro-Wilk检验分析各项指标正态分布情况，计量资料采用P50［P25，P75］表示，计数资料采用例数（n）及率（%）表示。组间比较采用Mean-WhitneyU秩合检验，组内两计量指标相关性分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AECOPD组和单纯感染组一般资料比较AECOPD组和单纯感染组一般资料比较结果显示，两组患者年龄、性别及吸烟差异均无统计学意义（P>0.05），资料具有可比性。AECOPD组WBC、NEU水平高于单纯感染组，PCT水平低于单纯感染组（P<0.05，表1）。

表1 AECOPD组和单纯感染组一般资料比较［例（%）］Tab.1 Baseline characteristics of patients in AECOPD and Lung Infection groups［n（%）］

2.2 两组患者BALF中CXCL13、IL-8、TNF-α和IL-6水平比较与单纯感染组相比，AECOPD组BALF中CXCL13［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］、IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/mlvs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］、TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］均显著升高，其中IL-8、TNF-α差异无统计学意义（P<0.05，图2）。

2.3 两组患者BALF中CXCL13与IL-8、TNF-α和IL-6相关性分析AECOPD组和单纯感染组BALF中CXCL13与IL-8、TNF-α和IL-6相关性分析结果显示，AECOPD组CXCL13与IL-8、TNF-α、IL-6呈负相关，但与IL-6差异无统计学意义（P>0.05）。单纯感染组CXCL13与IL-8、TNF-α也呈负相关，但与IL-6差异无统计学意义（P>0.05，图3）。

3 讨论

COPD的高发病率和高病死率给全球造成了巨大经济负担和社会负担，由于世界人口老龄化等因素，COPD造成的经济负担和社会负担在未来几十年将持续增加［1］。AECOPD可加快疾病进展，包括肺功能加速下降、生活质量严重受损和病死率提高，因此AECOPD防治是控制COPD恶化的关键要素之一［2］。CRISAFULLI等［4］发现因细菌感染导致AECOPD的患者（n=241）血液中IL-6、IL-8以及TNF-α水平均高于肺部细菌感染患者（n=41）。本研究显示，与单纯肺部感染组相比，AECOPD组IL-6［8.19（4.90，13.70）pg/ml vs 3.55（3.45，6.53）pg/ml，P=0.008］、IL-8［121.99（77.13，231.07）pg/ml vs 89.89（52.64，123.69）pg/ml，P=0.082］以及TNF-α［1.46（1.30，1.67）pg/ml vs 1.34（0.67，1.69）pg/ml，P=0.201］水平升高，与CRISAFULLI等［4］结果一致。此外，研究已证实急性炎症和慢性炎症中均有iBALT阳性表达，量化iBALT面积后发现，CXCL13与iBALT面积呈正相关［12-13］。本研究发现，慢性炎症性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13浓度显著高于急性细菌性肺炎患者［5.72（4.32，7.40）pg/ml vs 4.17（3.22，5.09）pg/ml，P=0.016］，提示慢性炎症急性发作时伴有iBALT面积增加。

不同病原体感染的急性肺部感染小鼠模型中发现，小鼠细支气管及血管周围均有iBALT形成，且iBALT面积与小鼠模型中病原体滴度呈正相关。随着病原体滴度下降，仍可观察到iBALT结构，当小鼠体内检测不到病原体滴度时，iBALT面积逐渐减少［9-18］。结 合SHAPOURI-MOGHADDAM等［14］及ZHANG等［19］对iBALT和巨噬细胞极化的相关性研究结论可推测，急性细菌性肺炎患者中，iBALT可能有利于抵御细菌感染。CXCL13作为iBALT的标志物，可通过CXCL13与促炎因子间的关系间接反映iBALT对病原体的作用。本研究发现，单纯肺部感染组CXCL13与促炎因子IL-8（r=-0.789，P<0.001）、TNF-α（r=-0.480，P=0.018）、IL-6（r=-0.280，P=0.171）呈负相关，证实iBALT在急性炎症期可抵御细菌感染。目前慢性炎症性疾病伴有急性细菌感染患者中iBALT的作用尚未涉及。本研究证实，AECOPD组CXCL13与IL-8（r=-0.925，P<0.001）、TNF-α（r=-0.886，P<0.001）、IL-6（r=-0.525，P=0.054）呈负相关，与单纯肺部感染组结果一致。因此推测慢性炎症性疾病伴有急性细菌感染患者中，iBALT也可能有利于抵御细菌感染。

虽然AECOPD组和急性细菌性肺炎组CXCL13与IL-6均呈负相关，但无统计学意义（P>0.05），可能 与IL-6可 促 进iBALT形 成 有 关［20］。BOTELHO等［21］证实，小鼠肺组织中IL-6表达可诱导并激活B细胞，有利于促进iBALT形成。此外，本实验收集的为患者支气管肺泡灌洗液，一定程度上限制了本研究样本量。目前研究认为痰诱导与支气管肺泡灌洗液结果一致，且痰诱导适应证广泛、禁忌证较少，因此未来可通过痰诱导收集患者痰液标本，进一步扩大样本量，以证实CXCL13与促炎因子的相关性［22］。

综上所述，慢性炎症性疾病伴有急性感染（AECOPD）患者CXCL13浓度显著高于单纯急性感染患者。此外，本研究发现AECOPD患者与iBALT相关细胞因子CXCL13和促炎因子（IL-8、IL-6和TNF-α）呈负相关，与急性细菌性肺炎患者结果一致，提示iBALT在慢性炎症性疾病伴有急性感染的患者中也可能有利于抵御细菌的感染，对AECOPD患者精准化治疗具有重要意义。