土荆皮乙酸通过PI3K/AKT通路抑制肺腺癌细胞A549上皮-间质转化①

宋佳易 刘春英

（辽宁中医药大学中西医结合学院，沈阳 110847）

肺癌是我国最常见恶性肿瘤之一，发病率与病死率呈逐年递增趋势，已成为人类健康的第一威胁［1-3］。肺癌恶性程度较高，70%~90%病例在手术过程中即发现病理类型为浸润性癌，五年生存率显著下降［4］。近年研究证实，上皮-间质转化（epithelialmesenchymal transition，EMT）与肿瘤发生、侵袭转移、耐药密切相关［5］。EMT是指在某种生理或病理条件下，具有紧密连接状态的上皮样细胞向纺锤形、多伪足、连接松散的间充质细胞形态过度的过程［6］。正常上皮细胞发生EMT时，肿瘤多处于原位癌阶段。肿瘤细胞继续发展则通过EMT原位扩散侵入血管和淋巴管进行远处转移［7-9］。EMT发生过程中，肿瘤上皮相关标志物E-Cad、α-CA表达下调，而间质细胞相关标志蛋白Vim、α-SMA表达增强［10-11］。

转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是EMT的重要诱导因子［12］。TGF-β1可与细胞表面相应受体结合，经过相关信号通路使该诱导因子与细胞相互作用，促发EMT［13］。相关动态研究发现，EMT过程中TGF-β和MAPK在起始阶段发挥协同作用，而维持阶段起主要作用的是PI3K/AKT通路［14］。本研究通过Transwell、Western blot和q-PCR等方法研究土荆皮乙酸（pseudolaric acid B，PAB）通过PI3K/AKT通路对肺癌细胞EMT及迁移、侵袭的影响。

1 材料与方法

1.1 材料肺癌A549细胞株（中国医学科学院肿瘤研究中心细胞库）；PAB（美国Sigma公司）；培养基（Hyclon公司）；E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA抗体（Proteintech公司）；Western blot试剂盒（博奥公司）；CO2恒温培养箱（Thermo-Forma）；倒置荧光显微镜（Leica）；荧光定量PCR仪（生命技术公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养取对数生长期A549细胞置于1640培养基培养48 h~72 h（含100 µg/ml链霉素的胎牛血清）。培养条件：37℃、5%CO2、饱和湿度。待细胞长满瓶底70%~80%时胰酶消化传代，待细胞长至70%融合加入无血清培养基饥饿培养12 h。

1.2.2 分组及处理CCK8实验显示PAB对TGF-β1诱导的肺癌A549细胞具有增殖抑制作用，且呈浓度依赖性。40 µmol/L PAB作用48 h，肺癌A549细胞达到半数抑制率，以此作为最佳作用浓度与最佳作用时间。空白组仅添加培养液，诱导组加入终浓度5 µg/L TGF-β1溶液，实验组在诱导组基础上，同时加入最佳浓度PAB（40 µmol/L）作用48 h至细胞贴壁生长。

1.2.3 Transwell实验检测细胞迁移、侵袭制备基质胶和终浓度药物进行添加或不添加PAB处理，按照上述分组加样，并添加5µg/L TGF-β1诱导剂至小室，再加入200µl细胞悬浊液至上室，10%胎牛血清至下室，37℃孵育24 h。取小室，弃上清，染色，显微镜观察，拍照。同样实验方法，不进行基质胶制备，检测A549细胞迁移能力。

1.2.4 免疫荧光实验取盖玻片，接种适量浓度细胞，3组细胞均分别培养48 h，固定，通透，封闭1 h。加入一抗孵育过夜后洗涤，加入二抗孵育后染色。显微镜下观察E-Cad表达情况并拍照。

1.2.5 Western blot检测蛋白表达3组细胞分别提取总蛋白，制备分离胶和浓缩胶，电泳，转膜，封闭，加入一抗、二抗孵育，测量各条带吸光度值，计算蛋白表达。

1.2.6 RT-qPCR实验采用Premier 5.0软件设计PCR引物序列，GAPDH正向引物：5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，反向引物：5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′；α-CA正向引物：5′-TCCTACGTCGCCTCTACC-3′，反向引物：5′-CTTCTGAGATGCCC‑GTTT-3′；Vim正向引物：5′-TTGAACGCAAAGTG‑GATTC-3′，反向引物：5′-AGGTCAGGCTTGGAAA‑CA-3′；α-SMA正向引物：5′-TCCCTTGAGAAGAGT‑TACGAGTT-3′，反向引物：5′-ATGATGCTGTTGTAGGTGGTT-3′。分别提取各组细胞样本总RNA，于冰上配制各反应体系后进行去DNA反应。测定样本纯度，合格后进行逆转录和PCR扩增反应，合成相应cDNA。

1.3 统计学分析采用SPSS16.0软件进行统计学分析，统计描述均符合正态分布，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PAB对TGF-β1诱导的A549细胞迁移、侵袭能力的影响Transwell检测PAB（40µmol/L）处理48 h的TGF-β1（5 µg/L）诱导的A549细胞，结果显示，PAB可显著抑制A549细胞迁移、侵袭能力（图1）。

图1 Transwell检测PAB对A549细胞迁移、侵袭的影响（×100）Fig.1 Transwell to detect effect of PAB on migration and invasion of A549 cells（×100）

2.2 PAB对TGF-β1诱导的A549细胞E-Cad蛋白表达的影响取PAB（40µmol/L）处理48 h的TGF-β1（5 µg/L）诱导的A549细胞，免疫荧光法检测E-Cad蛋白表达，结果显示，与空白组相比，诱导组E-Cad蛋白表达下调，与诱导组相比，实验组E-Cad蛋白表达上调（图2）。

图2 免疫荧光检测PAB对A549细胞E-Cad蛋白表达的影响（×100）Fig.2 Immunofluorescence to detect effect of PAB on expression of E-Cad protein in A549 cells（×100）

2.3 PAB对TGF-β1诱导的A549细胞PI3K/AKT信号通路的影响与空白组相比，诱导组p-PI3K及p-AKT蛋白表达显著增强（P<0.05），与诱导组相比，实验组显著抑制活化的p-PI3K及p-AKT蛋白表达，说明PAB可抑制PI3K/AKT信号通路活化（图3）。

图3 Western blot检测PAB对A549细胞PI3K、AKT表达的影响Fig.3 Western blot to detect effect of PAB on expressions of PI3K and AKT in A549 cells

2.4 PAB对TGF-β1诱导的A549细胞E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA蛋白表达的影响取PAB（40 µmol/L）处理48 h的TGF-β1（5 µg/L）诱导的A549细胞，Western blot检测E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA蛋白表达变化，结果显示，与空白组相比，诱导组E-Cad、α-CA蛋白表达下调，Vim、α-SMA蛋白表达上调。与诱导组相比，实验组E-Cad、α-CA蛋白表达上调，而Vim、α-SMA蛋白表达下调（图4）。

图4 Western blot检测PAB对A549细胞E-Cad、α-CA、Vim、α-SMA表达的影响Fig.4 Western blot to detect effect of PAB on expressions of E-Cad，α-CA，Vim and α-SMA in A549 cells

2.5 PAB对TGF-β1诱导的A549细胞α-CA、Vim、α-SMA mRNA表 达 的 影响PAB作 用48 h后，RT-qPCR结果显示，与空白组相比，诱导组α-CA mRNA表达下调，Vim、α-SMA mRNA表达上调。与诱导组相比，实验组α-CA mRNA表达上调，而Vim、α-SMA mRNA表达下调（图5）。

图5 RT-qPCR检 测PAB对A549细 胞 中α-CA、Vim、α-SMA表达的影响Fig.5 RT-qPCR detection of effect of PAB on expressions of α-CA，Vim and α-SMA in A549 cells

3 讨论

EMT可发生于生理和病理过程，肿瘤细胞伴随形态、黏着力、基质性状改变。病理条件下，肿瘤细胞出现EMT，转变为具有更高侵袭力的间充质细胞形态，入侵周围组织、血管、淋巴管，发生远处转移［15］。E-Cad、α-CA是主要的上皮标志蛋白，在维持细胞形态、参与细胞间黏附、保持细胞完整性中起重要作用。EMT发生过程中，上皮标志蛋白E-Cad、α-CA表达下降，而Vim、α-SMA表达上调［10-11］。作为一种重要的细胞因子，TGF-β1可在肿瘤发生进展中起促进作用，可与肿瘤细胞表面相关受体结合，促进多种转录因子表达，使上皮来源的肿瘤细胞失去原有的紧密连接状态而向纤维样、梭形细胞形态转变，促发EMT，肿瘤细胞也更易转移，相关上皮标志蛋白表达下降，间质标志蛋白表达升高。因此，抑制或阻断TGF-β1介导的肺癌A549细胞EMT发生，可成为抑制肿瘤发生、进展的新方向［16］。目前抑制EMT的相关报道较多，如单克隆抗体、miRNA及小分子药物等，而中药因其效果佳、副作用小而深受临床药物开发者青睐。

PAB也称为土槿皮乙酸，为中国特有松科植物金钱松的近根树皮提取物，具有杀虫止痒、祛风除湿作用［17］。始载于赵学敏的《本草纲目拾遗》，亦是《中华人民共和国药典》收载的常用中药，近年对PAB的研究越来越多，尤其是其抗肿瘤功效引起国内外学者广泛关注。但关于其逆转肺癌细胞EMT和侵袭转移的研究却鲜有报道。本研究验证了PAB可逆转TGF-β1介导的肺癌A549细胞EMT和侵袭转移能力。

PI3K/AKT信号通路在肿瘤发生、侵袭、转移及EMT等过程中起重要作用，因此，调控该信号通路对预防和逆转肿瘤细胞转移或耐药等恶性进程，发现临床治疗新靶点具有重要意义。研究表明，胰腺癌细胞发生EMT过程依赖于AKT激活［18］。研究显示，TGF-β1诱导EMT的过程中，PI3K/AKT激活必不可少［19］。E-Cad、α-CA作为EMT的重要上皮标志蛋白，受PI3K/AKT信号通路调控。AKT可被PI3K激活而磷酸化，使磷酸化后的AKT蛋白表达增强，进而下游转录因子表达上调，直接降低细胞内E-Cad、α-CA水平，导致EMT发生。另外，基质金属蛋白酶表达可受PI3K/AKT信号通路激活而升高表达，从而降解E-Cad、α-CA使细胞更易发生转移［20-21］。表明激活PI3K/AKT信号通路对诱导EMT、促进细胞转移有重要作用。本研究发现，TGF-β1诱导可促进肺癌A549细胞EMT进程，PAB处理后，不仅降低肺癌A549细胞EMT进程，PI3K/AKT信号通路也受到一定抑制作用，侵袭和转移能力被抑制，表现为上调E-Cad、α-CA蛋白表达水平而同时下调Vim、α-SMA、PI3K、AKT蛋白表达，进一步证实PAB可能通过抑制PI3K/AKT信号通路，降低AKT磷酸化蛋白表达，从而抑制TGF-β1介导的肺癌A549细胞EMT进程，进而抑制细胞迁移和侵袭。

综 上所 述，PAB可 抑制TGF-β1介 导 的肺 癌A549细胞EMT发生和迁移侵袭能力，其机制可能为通过抑制PI3K/AKT信号通路而实现，为PAB在肺癌分子靶向治疗中的应用提供参考。