健脾化瘀解毒方调控能量代谢抑制肺癌细胞侵袭转移的研究①

魏征 王艳春 李欢 侯留法 崔伟锋 张俊萍

（河南省中医药研究院，郑州 450004）

肺癌是目前是病死率最高的癌症之一，肺癌在癌症新发病例和死亡病例中均占据第一位［1］。肿瘤的侵袭转移是制约肺癌术后生存率提高的主要因素，因此寻找和研发抑制肺癌侵袭转移的抗肿瘤药物显得非常重要［2］。肿瘤细胞产生能量的方式比较特别，健康细胞依靠线粒体氧化糖类分子释放出大量能量，而大多数肿瘤细胞则通过产能率相对较低的糖酵解作用为自身供能，这就是Warburg效应［3］。同样在肺癌之中，Warburg效应为其转移提供能量基础，而miR-143-3p的表达可以抑制Warburg效应，从而阻碍肺癌细胞的增殖、侵袭、转移。己糖激酶2（hexokinase 2，HK2）是催化己糖使之磷酸化，糖酵解途径的第一个酶，也是Warburg效应的限速酶，HK2促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移，对于快速生长的肿瘤代谢行为来说是至关重要的［4］。前期研究发现，健脾化瘀解毒方（Jianpi Huayu Jiedu recipe medicated serum，JHJRMS）处理非小细胞肺癌A549细胞株，可抑制其增殖和侵袭［5］。健脾化瘀解毒方如何调控miR-143-3p抑制Warburg效应从而抑制肺癌侵袭转移尚不清楚。本研究拟进一步阐明健脾化瘀解毒方通过调控肺癌细胞能量代谢抑制肺癌侵袭转移的分子机制，为健脾化瘀解毒方的临床运用提供实验依据，也为肺癌的临床治疗提供新的思路和理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料为了保证试验药效的一致性，药物来源使用配方颗粒剂，确保指纹图谱的一致性。健脾化瘀解毒方配伍为生黄芪30 g（批号：1019012）、茯苓15 g（批号：1011882）、白术15 g（批号：1011542）、石见穿15 g（1017422）、半枝莲30 g（批号：0126832）、夏枯草30 g（批号：1025232）、全蝎3 g（批号：1013452）、天龙3 g（批号：6117692）、三七粉3 g（批号：7050862），均购自广东一方制药有限公司。健康SPF级大耳白兔购自河南省实验动物中心，许可证号：SCXK（豫）2015-0004。动物实验经河南省中医药研究院伦理委员会批准（HNZYYYJY2018-0010）。人肺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞库。RPMI1640培养基（Hyclone公司）；胰蛋白酶消化液（上海碧云天公司）；胎牛血清（Gibco公司）；反转录酶（TaKaRa公司）；Mix混合酶（罗氏公司）；HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9抗体、β-actin抗体、HRP-标记的二抗（Cell signaling公司）；乳酸检测试剂盒（Abcam公司）。SERIES 8000 WJ型恒温培养箱（Thermo公司）；倒置荧光显微镜（Olympus公司）；PCR仪（Roch公司）；Mini X25型垂直电泳仪、Universar HoodⅢ蛋白凝胶分析系统、凝胶成像系统（Bio-Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养人肺癌A549细胞用含10%FBS的RPMI1640培养基培养在恒温培养箱中（CO2含量为5%，温度为37℃）。使用对数生长期细胞，用胰蛋白酶消化，并重悬成单细胞悬液备用。

1.2.2 含药血清的制备将配方颗粒剂生黄芪30 g、茯苓15 g、白术15 g、半枝莲30 g、石见穿15 g、夏枯草30 g、全蝎3 g、天龙3 g、三七粉3 g换算成等效生药量配伍比例后生理盐水溶解，生药浓度为6 g/ml，待用。取SPF级大耳白兔12只，实验前禁食12 h，根据“人和动物体表面积折算的等效剂量比率表”计算出大耳兔的灌胃剂量，取8只给予健脾化瘀解毒方药30 g/（kg·d）剂量灌胃。对照组4只给予相同剂量的生理盐水，1次/d，连续灌胃1周。于末次用药后1 h，无菌条件下心脏采血，分离血清（其中包括含药血清和对应的对照血清），56℃、30 min下补体灭活，-20℃冰箱保存备用。根据前期研究数据：JHJRMS对A549细胞24 h的IC50=6.5% JHJRMS，后期实验采用浓度分组：低剂量组（含2%JHJRMS）、中剂量组（含4%JHJRMS）、高剂量组（含8%JHJRMS）和对照组（含8%对照组无药兔血清）以便于后期深入研究（注：低剂量组和中剂量组分别补充不含药血清6%和4%使最终每组的血清总含量一致，下同）。

1.2.3 HK2与肺癌患者预后生信分析选择TCGA数据库和GEPIA数据库，登录网站。从单基因分析方法进行研究，单基因选择：HK2。Survival Plots研究设置如下筛选标准：Gene=HK2，Methods=Overall Survival，Group Cutoff=Quartile，Hazards Ratio（HR）=No，95% Confidence Interval=Yes，Axis Units=Days，Datasets Selection（Cancer name）=LUAD。按照上述条件导出生存曲线图进行分析。

1.2.4 划痕实验检测JHJRMS对肺癌细胞侵袭迁移能力的影响先用Marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀划横线，大约每隔0.5~1 cm 1道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。在孔中加入约5×105个细胞，掌握为过夜能铺满。第2天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃、5%CO2培养箱，培养，拍照。

1.2.5 RT-PCR检测JHJRMS对miR-143-3p表达的影响正常培养人肺癌A549细胞，消化细胞均匀接种于6孔板中，孵育12 h后。用含不同浓度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640处理，对照组加入含8%对照组无药血清的培养基。继续孵育24 h后，提取RAN，运用RT-PCR检测不同组织中miR-143-3p的表情况。miR-143-3p的引物序列为F：5'-GGGGTGAGATGAAGCACTG-3'，R：5'-CAGTGCGT⁃GTCGTGGAGT-3'；U6引物序列为：F：5'-GCTTCG⁃GCAGCACATATACTAA-3'，R：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'，45个循环。对照组表达量标准化为1，取3次实验均数进行统计分析并绘制相对RNA表达量图。

1.2.6 Western blot检测JHJRMS对肺癌细胞中HK2蛋白表达的影响正常培养细胞，消化后将A549肺癌细胞均匀接种于6孔培养皿中，用含不同浓度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640处理，对照组加入含8%对照组无药血清的培养基，培养24 h。分别提取每组处理过的细胞总蛋白质，然后用SDS-PAGE在120 V恒定电压下分离90 min。然后，将蛋白质电转移到PVDF膜上，分别用抗体（HK2、E-cadherin、MMP-2、MMP-9和β-actin）进行孵育后，用对应的二抗孵育，最后用凝胶成像分析系统检测蛋白质条带。

1.2.7 乳酸生成速率测定用含不同浓度JHJRMS（2%、4%和8%JHJRMS）的RPMI1640处理肺癌细胞24 h后，分别吸取每组细胞上清待测。标准液的稀释：将100 mmol/L的标准溶液用蒸馏水稀释为10、5、2.5、1.25、0.625、0 mmol/L的标准溶液。将反应混合物添加到样品和标准孔中，37℃孵育30 min，用酶标仪分析（波长450 nm）。

1.3 统计学处理所有数据使用SPSS16.0统计软件进行分析。所有数据均表示为±s，P<0.05表示差异具有统计学意义，每个实验重复至少3次。

2 结果

2.1 HK2与肺癌患者预后之间的相关性为了明确HK2在肺癌预后中的关系，利用TCGA和GEPIA数据库调取肺癌患者信息进行分析，结果发现，KH2在肺癌组织中的表达略高于正常肺组织，但差异无统计学意义（P>0.05），在肺癌不同分期中的表达也无明显差异（P>0.05）。HK2在生存率高的患者中多数低表达（P<0.01）。这提示HK2可能是一个不良预后的生物标志物之一，抑制其表达可能会提高肺癌患者的生存率，如图1所示。

图1 HK2与肺癌预后之间的相关性图表Fig.1 Correlation chart between HK2 and lung cancer prognosis

2.2 JHJRMS对肺癌细胞侵袭转移能力的影响为了探明JHJRMS对肺癌细胞侵袭转移能力的影响，划痕实验用来检测JHJRMS抑制肺癌细胞侵袭转移的能力，结果发现，与对照组相比，JHJRMS处理后，肺癌细胞的伤口愈合速度明显降低，并且呈一定的浓度依赖性，如图2所示。

图2 伤口愈合实验照片Fig.2 Pictures of wound healing experiments

2.3 JHJRMS对肺癌细胞中HK2蛋白以及侵袭转移相关蛋白表达的影响为了明确健脾化瘀解毒方对HK2蛋白表达的影响和再次验证JHJRMS对于肺癌细胞侵袭转移的影响，用不同浓度的JHJRMS处理肺癌细胞，提取各组细胞的总蛋白进行Western blot检测。结果发现，JHJRMS可显著降低肺癌细胞中HK2的表达水平。侵袭转移相关蛋白N-cadherin、MMP-2和MMP-9等显著降低（P<0.001），如图3所示。

图3 侵袭转移相关蛋白表达的检测结果Fig.3 Results of invasion and metastasis related protein expression

2.4 JHJRMS可显著增强miR-143-3p在肺癌细胞中的表达同时降低乳酸的生成为了进一步明确JHJRMS对miR-143-3p的表达影响，用不同浓度的JHJRMS对肺癌细胞进行处理，提取各组细胞的RNA进行PCR检测，结果发现，JHJRMS可以明显促进肺癌细胞中miR-143-3p的表达（P<0.01），如图4A所示，同时检测各组细胞的乳酸生成水平，结果发现JHJRMS可以明显抑制肺癌细胞的乳酸生成（P<0.05），如图4A所示。

图4 JHJRMS对肺癌细胞中miR-143-3p表达和乳酸生成的影响Fig.4 Effect of JHJRMS on miR-143-3p expression and lactate production in lung cancer cells

2.5 miR-143-3p靶向调控HK2蛋白的有效结合位点及相关评分运用相关软件（TargetScan，miRBase）预测miR-143-3p的靶标蛋白，结果发现miR-143-3p和HK2蛋白的mRNA存在多处互补链（如图5），miR-143-3p很可能靶向调控HK2蛋白的表达。

图5 miR-143-3p靶向调控HK2蛋白的有效结合位点及相关评分Fig.5 miR-143-3p targets and regulates effective binding site and related scores of HK2 protein

3 讨论

肺癌是全世界范围内病死率最高的癌症，占癌症死亡人数的21%。传统中医（traditional Chinese medicine，TCM）虽无肺癌之名，但其在肺癌临床治疗方面接受度越来越高。健脾化瘀解毒方源于中医治疗肿瘤的“扶正祛邪”法则，作为国家中医药管理局重点专科常用院内制剂，前期临床研究取得了良好的临床疗效［6］，前期课题组体外实验证实健脾化瘀解毒方可抑制肺癌细胞的增殖和侵袭转移。多项国内外研究表明，中医药可以通过调控miRNA的表达水平，抑制肺癌的发生发展［7］。miR-143-3p在多种肿瘤中均起到抑癌作用［8-10］，通过调控Warburg效应抑制肿瘤的发生发展，但其中的具体作用机制尚不清楚。本研究发现并证实了miR-143-3p抑制肺癌侵袭转移的靶蛋白HK2。而HK2是糖酵解途径的第一个酶，也是Warburg效应的限速酶，参与Warburg效应［11］。HK2对于快速生长的肿瘤代谢行为至关重要，可以促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡，促进细胞侵袭和转移［12］。本研究发现，HK2是miR-143-3p的靶标蛋白之一，鉴于JHJRMS可以促进miR-143-3p的表达丰度，而miR-143-3p可以负向调节HK2的表达。推测JHJRMS是否可以通过此途径来降低HK2蛋白的表达从而抑制肿瘤的Warburg效应呢？本研究首先分析了HK2与肺癌患者的预后关系，从侧面观察HK2在肿瘤代谢过程中的关键作用。经过研究发现HK2与肺癌患者的预后密切相关，低表达HK2的肺癌患者群组拥有更长的生存期限，这说明HK2在肺癌发展中的关键作用，很可能是预测肺癌患者预后的重要生物学标志［13］。伤口愈合实验进一步发现，JHJRMS可明显降低肺癌细胞的伤口愈合能力，抑制肺癌细胞的侵袭和转移。这说明JHJRMS对肺癌侵袭转移能力具有明显的抑制作用。因此推测JHJRMS是否可以通过调控miR-143-3p直接作用其靶蛋白HK2的表达，从而抑制肺癌细胞的Warburg效应来达到抑制肺癌细胞的侵袭转移呢？为了明确miR-143-3p和HK2在其中的作用，进一步检测了miR-143-3p和HK2的表达情况。运用RT-PCR检测JHJRMS对肺癌细胞中miR-143-3p表达的影响，结果显示，随着JHJRMS的加入，肺癌细胞中的miR-143-3p表达水平显著升高，说明JHJRMS可以增加miR-143-3p的表达。为了寻找miR-143-3p的靶标蛋白，利用TargetScan和miRBase两个网站对其结合的潜在靶标蛋白进行了预测，结果发现，调控Warburg效应的HK2蛋白的mRNA与miR-143-3p有多个互补位点，说明能够有效靶向性调节HK2蛋白。为了证实上述调控关系，进行Western blot实验，结果发现，JHJRMS可以明显抑制HK2蛋白的表达，同时抑制肺癌细胞侵袭转移相关蛋白N-cadherin和MMPs的表达。这也就是说，JHJRMS很可能是通过调控肺癌细胞中miR-143-3p的水平，抑制HK2蛋白的表达，从而抑制肺癌细胞的糖酵解过程进而抑制肺癌细胞的侵袭转移。

综上所述，本研究通过一系列实验证实了miR-143-3p的靶蛋白HK2和肺癌患者预后之间的关系，证实了JHJRMS可以在体外抑制肺癌细胞的侵袭转移，其机制可能是通过上调肺癌细胞中miR-143-3p进而抑制其靶蛋白HK2的表达，抑制细胞的Warburg效应，实现其抑制侵袭转移的功能。该研究将为健脾化瘀解毒方的临床运用提供有力的实验依据，为抗肺癌侵袭转移的中药开发奠定一定基础。