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温胆汤方剂对睡眠剥夺小鼠氧化应激及炎症反应的影响

2022-02-21李莉刘茹何晶陈云郭娟陈红刘玲

中国免疫学杂志 2022年3期
关键词:温胆汤艾司脑组织

李莉 刘茹 何晶 陈云 郭娟 陈红 刘玲

(湖北省中医院,湖北省中医药研究院,湖北中医药大学附属医院,武汉 430074)

失眠是一种严重的公共卫生问题,其患病率较高,约30%以上的人口患有失眠症状,约10%的人口符合睡眠障碍的标准[1]。失眠症是全球神经精神障碍的十大原因之一,而且有负面影响的后遗症,譬如日间疲劳、认知困难、情绪调节受损和生活质量下降,严重影响公众健康,但人们对失眠症的潜在病理生理学或失眠影响身心健康的机制知之甚少[2],这便给失眠的有效治疗带来了很大障碍。失眠在中医学属于“不寐”“不得卧”“不得眠”的范畴[3],常见的中医治疗方法包括中药汤剂、推拿、针灸、火罐、刺血等,相较于西药的单靶点机制,中药治疗具有多靶点、多途径改善失眠症状的优势[4]。温胆汤为中医学经典方剂之一,具有理气化痰、利胆合胃的功效,温胆汤在失眠的临床治疗上具有较好效果,值得推广[5]。然而,关于温胆汤治疗失眠的具体分子机制尚未完全阐明。吴蕾[6]研究结果显示,温胆汤可减缓人脐静脉内皮细胞损伤中的氧化应激,改善炎症损伤。而失眠与氧化应激、炎症反应存在关联[7-8],故推测温胆汤可能通过调控氧化应激和炎症损伤来改善失眠。本研究采用改良版水平转盘睡眠剥夺法构建失眠小鼠模型[9],采用温胆汤进行治疗,检测小鼠氧化应激水平以及炎症细胞因子水平变化,以期阐明温胆汤治疗失眠的可能机制,为中医药治疗失眠提供更多的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物30只SPF级昆明种雌性小鼠,4~5周龄,体质量为(20±2)g,购自三峡大学实验动物中心。

1.1.2 温胆汤方剂6 g半夏(批号:19021091)、6 g竹茹(批号:18122371)、6 g麸炒枳实(批号:19031361)、9 g陈皮(批号:19051171)、3 g炙甘草(批号:19040261)、4.5 g茯苓(批号:19061131),每剂含生药34.5 g,均由湖北省中医院门诊中药房提供。一煎,药材8倍水煎制,沸腾后煎40 min,过滤取汁;二煎,6倍水煎制,沸后煎30 min,过滤取汁,2次汁液混合后,浓缩成1∶1药液备用。

1.1.3 主要试剂艾司唑仑片购自襄阳市华中药业股份有限公司;DMEM培养基购自美国Hyclone公司;胎牛血清购自美国Gibco公司;活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司;谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)测定试剂盒、髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)测定试剂盒、还原型谷胱甘肽(glutathione,GSH)测定试剂盒及丙二醛(malondialdehyde,MDA)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA试剂盒、兔抗核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)抗体、羊抗兔IgG抗体均购自武汉贝茵莱生物科技有限公司;兔抗p-NF-κB抗体购自美国CST公司;RIPA(强)组织细胞快速裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 睡眠剥夺小鼠构建通过改良版水平转盘睡眠剥夺法构建失眠小鼠模型。使用亚克力塑料板构建睡眠剥夺箱(长:110 cm、宽:60 cm、高:40 cm),其底部固定有15个圆柱形平台(直径:6.5 cm、高:8 cm),保持10 cm纵向间距,13 cm横向间距,注入23~25℃水至平台下1 cm处,保持水温。适应性培养7 d后,将24只待造模小鼠放置于睡眠箱平台上进行站立训练,当其即将进入睡眠时,由于肌肉松弛垂头触水或落入水中而惊醒,使其被迫保持清醒站立,早晚各拿出休息1次,每次30 min,训练2周。造模期间,每2 d记录1次小鼠行为学改变(精神状态、饮食)、毛发和体质量。

1.2.2 分组与处理30只SPF级昆明种雌性小鼠随机挑选6只作为对照组,剩余24只构建睡眠剥夺模型,并随机分为4组:模型组、温胆汤低浓度组(含生药0.5 g/ml)、温胆汤高浓度组(含生药2 g/ml)、艾司唑仑片组(0.15 mg/kg),每组6只。于模型构建的第8天开始灌胃,1次/d,共7 d,低、高剂量组及艾司唑仑片组分别灌入0.5 ml相应浓度的温胆汤剂或艾司唑仑片溶液,对照组和模型组小鼠给予等体积生理盐水灌胃。最后1次给药干预12 h后,眼眶采血0.5~1 ml,离心制备血清。100 mg/kg戊巴比妥钠过量麻醉处死小鼠,收集小鼠脑组织,于-80℃冰箱保存。

1.2.3 流式检测小鼠脑组织ROS水平取出小鼠脑组织,用含5%双抗的PBS漂洗3次,置于200目细胞筛中,用玻璃杯轻轻研磨脑组织,研碎后用DMEM冲洗,经过细胞筛获得细胞悬液。吸管吹打细胞悬液后,175 g离心5 min,弃上清,重复清洗2次,PBS重悬细胞后备用。收集细胞,按照1∶1 000用无血清培养基稀释DCFH-DA,使其终浓度为10 μmol/L重悬细胞,将细胞浓度调整为1×106个/ml,于5%CO2、37℃细胞恒温培养箱内孵育,为使探针和细胞充分接触,每隔3~5 min颠倒混匀1次。孵育20 min后,无血清培养基洗涤细胞去除多余的DCFH-DA,重复3次。收集各组细胞,上机检测,NovoCyte分析软件对其进行分析。

1.2.4 生化检测小鼠血清和脑组织GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA浓度根据试剂盒说明书,分别检测小鼠血清和脑组织中GSH-PX、SOD、MPO活性及GSH、MDA浓度。

1.2.5 ELISA检测小鼠血清和脑组织IL-6、TNF-α及IL-1β浓度根据ELISA试剂盒说明书,分别检测小鼠血清和脑组织中炎症因子IL-6、TNF-α及IL-1β浓度。

1.2.6 Western blot检 测 小 鼠 脑 组 织NF-κB及p-NF-κB蛋白表达将脑组织剪碎,置于冰上使用裂解液裂解,4℃、12000 g离心15 min,吸取上清液获取总蛋白。根据BCA定量结果上样,12% SDSPAGE凝胶电泳,转膜至PVDF膜,5%脱脂牛奶4℃封闭过夜,加入1∶1000稀释后一抗(NF-κB、p-NFκB、GAPDH),室温孵育1 h后,PBS洗涤3次,每次5 min。加入1∶20 000稀释后HRP标记的二抗,室温孵育1 h后,PBS洗涤3次,每次5 min。曝光显影,并进行灰度值分析。

1.3 统计学分析实验数据采用SPSS22.0统计软件进行分析,计量数据以±s表示,采用单因素方差分析法进行多组间差异分析,以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 温胆汤方剂改善失眠小鼠一般症状与对照组相比,模型组小鼠精神状态及毛发较差,饮食量减少,体质量显著下降(P<0.05);与模型组相比,温胆汤低、高浓度组及艾司唑仑片组小鼠以上症状有所改善,体质量显著增加(P<0.05),且高剂量组体质量改善情况显著高于低剂量组(P<0.05),见图1。

图1 小鼠处死前体质量比较Fig.1 Comparison of mice weight before death

2.2 温胆汤方剂降低失眠小鼠脑组织中ROS水平模型组小鼠脑组织ROS水平较对照组显著升高(P<0.05)。相较于模型组小鼠,温胆汤低、高浓度组及艾司唑仑片组小鼠脑组织ROS水平明显降低(P<0.05),且温胆汤高浓度组降低效果显著高于低剂量组(P<0.05),见图2。

图2 小鼠脑组织ROS水平Fig.2 ROS levels in brain tissues of mice

2.3 温胆汤方剂缓解失眠小鼠氧化应激与对照组相比,模型组小鼠血清和脑组织中GSH-PX、SOD和GSH酶活显著降低(P<0.05),MPO及MDA浓度均显著增加(P<0.05);与模型组相比,温胆汤低、高浓度组及艾司唑仑片组小鼠血清和脑组织中GSHPX、SOD和GSH酶活显著升高(P<0.05),MPO及MDA浓度显著降低(P<0.05),见表1、表2。

表1 小鼠血清中氧化应激因子水平(±s)Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice(±s)

表1 小鼠血清中氧化应激因子水平(±s)Tab.1 Levels of oxidative stress factors in serum of mice(±s)

Note:1)P<0.05 vs control;2)P<0.05 vs model;3)P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/(U·ml-1)194.70±14.29 123.03±6.021)151.40±4.092)167.27±7.642)3)172.24±2.292)3)SOD/(U·ml-1)111.88±13.22 25.38±4.491)40.24±3.032)68.17±1.952)3)70.78±3.672)3)GSH/(μmol·L-1)64.04±2.05 20.46±1.971)35.27±3.192)41.94±1.692)3)49.56±1.122)3)MPO/(U·L-1)13.40±0.70 39.31±2.741)29.52±2.292)23.18±1.492)3)20.09±0.672)3)MDA/(nmol·ml-1)20.72±1.82 84.44±2.251)67.11±5.822)56.30±2.392)3)53.53±2.932)3)

表2 小鼠脑组织中氧化应激因子水平(±s)Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice(±s)

表2 小鼠脑组织中氧化应激因子水平(±s)Tab.2 Levels of oxidative stress factors in brain tissues of mice(±s)

Note:1)P<0.05 vs control;2)P<0.05 vs model;3)P<0.05 vs L-density.

Groups Control Model L-density H-density Estazolam tablets GSH-PX/(U·mgprot-1)193.79±9.81 119.04±2.391)151.68±5.952)164.70±4.342)3)174.48±2.732)3)SOD/(U·mgprot-1)117.13±8.33 26.90±6.951)42.21±3.622)60.77±1.872)3)74.20±3.872)3)GSH/(μmol·gprot-1)67.69±3.88 20.56±1.071)36.53±1.182)42.27±3.282)3)53.89±2.572)3)MPO/(U·gwet weight-1)13.34±0.53 41.08±2.291)30.10±1.152)21.09±0.312)3)20.69±0.162)3)MDA/(nmol·mgprot-1)19.89±0.93 86.00±3.211)67.06±1.752)48.53±5.272)3)45.43±8.272)3)

2.4 温胆汤方剂降低失眠小鼠炎症细胞因子水平与对照组相比,失眠模型小鼠血清及脑组织中TNF-α、IL-6和IL-1β浓度显著升高(P<0.05);与模型组相比,温胆汤低、高浓度组及艾司唑仑片组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β浓度显著降低(P<0.05),且温胆汤高浓度组和艾司唑仑片组效果更显著(P<0.05),见图3。

图3 小鼠血清(A)及脑组织(B)炎症因子浓度Fig.3 Concentration of inflammatory cytokines in serum(A)and brain tissue(B)of mice

2.5 温胆汤方剂抑制失眠小鼠脑组织NF-κB蛋白磷酸化水平模型组小鼠脑组织p-NF-κB蛋白相对表达量较对照组显著增加(P<0.05),温胆汤及艾司唑仑片干预后小鼠脑组织中p-NF-κB蛋白相对表达量较模型组显著降低(P<0.05),且随温胆汤浓度的增加,其相对表达量降低更为显著(P<0.05),见图4。

图4 小鼠脑组织中p-NF-κB蛋白表达量Fig.4 Expression of p-NF-κB protein in brain tissue of mice

3 讨论

失眠的治疗方法主要分为2种,药物治疗和非药物治疗(包括认知行为治疗和心理治疗、替代治疗方法),临床上药物干预多为唑吡坦、埃索匹克隆和扎莱普隆、褪黑激素等,但西药干预会导致不良反应的发生[10]。中医药治疗失眠疗效显著,对失眠发病过程的理解也十分独到,引起失眠的病位包括心、肝、脾等,影响因素有瘀血、痰等,二陈汤、温胆汤等则以化痰理气为特点,在治疗失眠上取得了较好的疗效[11]。温胆汤相较于临床上常用的抗失眠药物,作用温和,无不良反应及耐药性[12]。本研究采用温胆汤治疗睡眠剥夺小鼠,其毛发、饮食及体质量逐渐趋于正常,提示温胆汤能改善睡眠剥夺引起的相关症状。

KOLESNIKOVA等[13]研究发现绝经后失眠妇女的脂质过氧化过程和抗氧化防御系统失衡,氧化应激反应明显。王新源等[14]检测失眠症患者血清中GSH-PX、MDA、SOD等活性水平发现失眠症患者氧化应激水平显著高于健康人,提示氧化应激可能参与了失眠症的发病过程。在本次研究中,睡眠剥夺小鼠脑组织ROS水平显著升高,血清及脑组织中MPO及MDA浓度升高,GSH-PX、SOD和GSH酶活显著降低,提示小鼠氧化应激严重,与上述研究结果一致。睡眠障碍会导致多种医学问题,包括认知障碍、免疫功能下降、代谢失衡等[15]。临床检测发现失眠患者炎症因子水平显著高于正常对照者[16]。SU等[17]研究也显示失眠剥夺大鼠脑内的TNF-α和IL-6水平显著增加;本次研究结果与之一致,睡眠剥夺小鼠血清和脑组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高。失眠会导致与心脑血管疾病、糖尿病等慢性疾病相关的炎症标志物增加,NF-κB作为炎症反应的关键因子之一,也会出现表达量增多[18]。王甜甜[19]发现温胆汤对胰岛素抵抗大鼠的改善作用可能是通过减轻大鼠体内氧化应激水平,改善炎症状态来实现的。因此,推测温胆汤可改善机体内的氧化应激及炎症水平,但对于失眠是否有相应作用尚不可知,故本研究采用低、高浓度温胆汤治疗睡眠剥夺小鼠,检测到小鼠血清及脑组织中MPO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平均显著低于模型组,脑组织中NF-κB磷酸化水平降低,GSH-PX、SOD和GSH酶活升高,提示温胆汤可调理失眠小鼠体内的氧化应激及炎症水平。

综上所述,温胆汤可明显改善睡眠剥夺小鼠精神萎靡、体质量减轻等症状,其作用可能与降低小鼠氧化应激和炎症水平有关。众所周知,中药具有多靶点、多途径治疗的特点,所以本文研究结果仅为温胆汤治疗失眠的部分作用,后续将从其他方面进行探讨,希望能提供更多温胆汤的药理作用,为其临床治疗失眠奠定基础。

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