两种檵木叶中黄酮类成分含量随生长期变化研究

冯 曦，张千千，丁志高，周 洁，赵碧清

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410208)

檵木叶为金缕梅科植物檵木Loropetalumchinense(R.Br.)Oliv.的干燥叶，是常用的民间药，具有清热解毒、收敛、止血的功效，用于治疗烧、烫伤，外伤出血、吐血，崩漏，腹泻[1]。《植物名实图考》记载：檵木“捣烂敷刀刺伤，能止血”[2]。《湖南药物志》中也有檵木药用的记载[3]，其根、叶、花均可入药。

白花檵木为檵木的别称，在长江中下游地区山野及丘陵灌丛中有广泛分布，红花檵木则由檵木变种而来，也是重要的民间药用资源[4]。檵木中药用活性成分包括挥发油[5-6]、鞣质、黄酮类、木脂素类和萜类等[7]，其中黄酮类化合物是檵木叶中含量较高的一类物质，含有槲皮素、山柰酚等[8]。有研究发现，槲皮素具有抗氧化、抗炎、抗癌以及抗纤维化等药理作用[9]，山柰酚具有抗癌、抗氧化、抗病毒、抗炎、抗菌以及降血糖等药理作用[10]。目前，对檵木叶的研究较多[11-15]，但未见关于红花檵木叶、白花檵木叶中槲皮素、山柰酚含量随生长期变化的研究，以及其含量差异比较的研究。由于白花檵木叶、红花檵木叶的采收期并不明确，故本研究采用高效液相色谱法考察白花檵木叶、红花檵木叶中两种黄酮类成分槲皮素、山柰酚的含量，并研究其含量随生长期变化的情况，考察不同时期两种檵木叶中槲皮素、山柰酚的含量差异，以确定白花檵木叶、红花檵木叶的最佳采收期，也为红花檵木叶能否替代白花檵木叶药用提供可靠的实验数据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津公司)；CP214 型电子天平(万分之一，奥豪斯仪器(常州)有限公司)；JE1002型电子天平(百分之一，上海浦春计量仪器有限公司)；FW177中草药粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；双列式电热恒温水浴锅(琴台医疗器械厂)；AS系列超声波清洗机(220 V/50 Hz)(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)。

1.2 试药

槲皮素对照品(批号：CHB190117，成都克洛玛生物科技有限公司，纯度≥98%)；山柰酚对照品(批号：CHB190127，成都克洛玛生物科技有限公司，纯度≥98%)；乙腈为色谱纯，水为二次蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

不同月份的白花檵木叶、红花檵木叶于2019年采自湖南中医药大学校园内，经湖南中医药大学药学院中药鉴定教研室周小江教授鉴定为正品。

2 方法与结果

2.1 高效液相色谱法测定红花檵木叶、白花檵木叶中槲皮素、山柰酚含量

2.1.1 色谱条件 Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm，5μm)；流动相为乙腈-0.4%磷酸水溶液(30∶70)，等度洗脱，流速：1.0 mL/min；检测波长360 nm；柱温30 ℃。混合对照液进样体积为10 μL，供试品溶液进样体积为20 μL，色谱见图1。

注：1.槲皮素；2.山柰酚。

2.1.2 混合对照品溶液制备 精密称取干燥至恒重的槲皮素、山柰酚对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含槲皮素1.38 mg、山柰酚1.65 mg的对照品贮备液。精密吸取各对照品贮备液适量，加甲醇稀释成每1 mL中含槲皮素 27.6 μg、山柰酚33.0 μg的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取檵木叶细粉1.0 g于锥形瓶中，精密加入80%甲醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，以80%甲醇补足减失的重量，滤过，精密吸取续滤液25 mL于锥形瓶中，加入5%盐酸10 mL及甲醇5 mL，水浴回流30 min，取出，放冷，转移至50 mL量瓶中，定容，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.1.4 方法学考察 (1)线性关系考察。精密移取槲皮素、山柰酚对照品贮备液适量，依次逐级稀释，定容，摇匀，配制得到6个浓度梯度的对照品混合溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样，以对照品质量为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，进行回归，见表1。表明两组分在各自质量范围内线性关系良好。

表1 两组分线性关系

(2)精密度试验。取“2.1.3”项下供试品溶液适量，在“2.1.1”项色谱条件下连续进样6次。测得槲皮素、山柰酚峰面积RSD分别为1.42%、0.41%，均小于2.0%，表明仪器精密度良好。

(3)稳定性试验。取“2.1.3”项下供试品溶液适量，分别于0、2、4、8、10、24 h进样，测得槲皮素、山柰酚峰面积RSD分别为0.86%、0.74%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

(4)重复性试验。精密称取檵木叶样品细粉1.0 g，共6份，按“2.1.3” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项下色谱条件进样，测得槲皮素、山柰酚的含量RSD分别为1.77%、2.37%，说明该方法重复性良好。

(5)加样回收率试验。取已知含有量样品细粉0.5 g，共9份，分别加入高、中、低3种不同量的槲皮素、山柰酚对照品，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1”项色谱条件下进样，计算两组分回收率。见表2。

表2 两组分加样回收率试验结果

2.2 两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量随生长期变化

于4月-10月的每月15日同时采摘两种不同的檵木叶500 g，60 ℃干燥至干(控制含水量在4.5%～4.6%)，粉碎，过3号筛，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取供试品20 μL，在“2.1.1”项色谱条件下进样，测得槲皮素、山柰酚含量，并计算其含量平均值及标准差。见表3。

表3 两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量平均值及标准差 (n=3)

将不同月份两种檵木叶中槲皮素、山柰酚的含量结果用直方图表示，见图2。

A.红花檵木叶、白花檵木叶中槲皮素含量比较

并采用95%可信区间重叠法比较不同采收时间的两种檵木叶中槲皮素、山柰酚的含量差异，见表4。

由表4可知，红花檵木叶中槲皮素、山柰酚含量均是7月份最高(95%可信区间未重叠，有统计学意义)，最佳采收期为每年7月份。

表4 两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量95%可信区间重叠法

白花檵木叶中槲皮素含量是7月份最高，而5至6月份的白花檵木叶中山柰酚含量比其他月份高(95%可信区间未重叠，有统计学意义)，5至6月份白花檵木叶中山柰酚含量95%可信区间重叠，差异无统计学意义，故需白花檵木叶中槲皮素含量高时，则每年7月份采收最佳，如需白花檵木叶中山柰酚含量高，则宜于每年5至6月份采收。

2.3 两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量差别比较

将不同生长期的两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量采用配对t检验进行统计分析，见表5。

表5结果表明，红花檵木叶中槲皮素含量远高于白花檵木叶中槲皮素含量，差异具有显著统计学意义(t=5.60，P=0.001 4)；白花檵木叶比红花檵木叶中山柰酚含量更高，具有统计学差异(t=3.35，P=0.015 4)，由此可见，红花檵木叶与白花檵木叶质量差异较大，不能互相替换使用。

表5 两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量差别的配对t检验结果

3 讨论

《中华人民共和国药典》中并未收载檵木叶的质量标准，故在文献研究基础上采用高效液相色谱法测定槲皮素、山柰酚的含量，并进行了方法学考察。结果显示，该实验的重复性、稳定性、精密度、加样回收率皆达到定量分析要求，可用于本项研究。

采用95%可信区间重叠法[16]适于多组之间比较，简单明了，一目了然。由于实验数据不随机，故采用配对t检验对两种不同檵木叶中槲皮素、山柰酚进行统计分析。

檵木叶一般于夏、秋季枝叶茂盛时采收，采收时间不具体，前期研究发现不同采收时间两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量差异较大，本课题系统研究了4-10月的两种檵木叶中槲皮素、山柰酚含量随生长期的变化情况，从而确定了两种檵木叶的最佳采收期，同时比较了两种檵木叶的质量差异，从而确定红花檵木叶、白花檵木叶不能替换使用。