基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术的明日叶化学成分鉴定

张 烨，邓 琦，魏 敏，付常清，张 旭*

(1.成都中医药大学 药学院，四川 成都 611137；2.四川康和鼎盛大健康产业集团有限公司，四川 成都 610000；3.四川斯力健农业科技有限公司，四川 成都 641400)

明日叶(Angelica keiskei)为伞形科当归属多年生草本植物，味甘，性温，归心、肝、大肠经[1]。现代药理学研究表明，其化学成分包括查尔酮、黄酮、香豆素、萜类等，具有增强人体免疫力、抗溃疡、抗血栓、降胆固醇、降血脂、防癌变等功效。

明日叶含有与人类健康密切相关的多种生理功效成分，极具开发价值。目前，我国明日叶仅南方种植产区种植，面积约1万hm2，年产量500 kg左右[4]，其产品(明日叶保健茶、保健饮料、保健胶囊等)在市场流通[5]。近年来，已有研究采用多种色谱方法对明日叶化学成分进行了化合物分离，但得到的化合物不超过20个；使用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)对明日叶进行成分鉴定，仅鉴定了10余个查尔酮类成分。此外，关于明日叶的药效物质基础研究主要集中于查尔酮类化合物上，对明日叶质量评价也以测定查尔酮类化合物中的4-羟基德里辛和黄色当归醇含量为主[14]。但明日叶化学成分复杂，仅少数查尔酮类成分难以对其质量及药效进行全面、精准地评价，且尚无关于明日叶的系统化学成分研究，基于此，建立一种灵敏、快速、准确的方法全面分析鉴定明日叶中的化学成分，对其质量标准提升和药效物质基础研究具有现实意义。

本实验采用超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱(Ultra-High Performance Liquid Chromatography Coupled with Hybrid Quadrupole-Orbitrap High-Resolution Mass Spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS)技术对明日叶的化学成分进行快速分析，共鉴定了68个化合物，可为明日叶及其产品的质量评价及药效物质基础研究提供理论依据和方法学参考，现报道如下。

1 材料

1.1 仪器

Vanquish型超高效液相色谱联用Q-Exactive型四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)，BT-40E型超声波清洗器(成都雅源科技有限公司)，BAS124S型1/1万电子天平和BT125Max型1/10万分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)，SL-100型高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司)。

1.2 药品与试剂

对照品：均购于成都埃法生物科技有限公司，包括补骨脂素、花椒毒素、异补骨脂素、佛手苷内酯、7-去甲基软木花椒素、异欧前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖(批号分别为AF9061521、AF9-022001、AF20071051、AF20060853、AF9121302、AF20021922、AF9111051、AF20050152、AF2007-1052，质量分数均≥98%。甲醇、甲酸均为色谱纯，分别购自美国Fisher公司和德国CNW科技公司；水为纯净水，购自杭州娃哈哈集团有限公司。

1.3 药材

明日叶(批号：20200603)购于四川斯力建农业科技有限公司，经成都中医药大学药学院龙飞副教授鉴定为多年生草本植物伞形科当归属明日叶(Angelica keiskei)的干燥茎叶。

2 方法

2.1 色谱条件

WatersACQUITY UPLC BEH-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)；流动相为0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B)，梯度洗脱：0-6 min，20%B～50%B；7-12 min，65% B～75% B；13-23 min，90% B～100% B；23-28 min，100%B；流速：0.15 mL/min；柱温：30 ℃，进样量：3 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾离子源(ESI)，正、负离子监测模式；质量扫描范围m/z100～1 500；裂解电压(+)3.50 kV、(-)3.00 kV；鞘气流速35 L/min；辅助气流量10 L/min；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式：Full MS/dd-MS2；Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500。MS/MS模式时，正离子模式下的碰撞能分别为20、40、60 eV，负离子模式下的碰撞能分别为20、40、60 eV。

2.3 供试品溶液制备

将干燥的明日叶粉碎，称取适量本品粉末(过二号筛)约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，浸泡1 h，超声处理(250 W、40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，进样前用0.22 μm 微孔滤膜滤过。

2.4 对照品溶液配制

取补骨脂素、花椒毒素、异补骨脂素、佛手苷内酯、7-去甲基软木花椒素、异欧前胡素、水合氧化前胡素、甘草素、蔗糖对照品适量，加甲醇超声溶解，定容至25 mL，配置成质量浓度约为0.05 mg/mL的单一对照品溶液置于4 ℃冰箱中保存，进样前过0.22 μm微孔滤膜。

2.5 数据处理

将高分辨质谱采集的原始数据导入Thermo Compound Discover(CD)3.0分析软件进行初步计算，设置CD向导、创建方法模板，建立未知化合物的鉴定流程，对采集的原始数据进行峰对齐和峰提取，结合mzCloud、mzVault、Chemspider网络数据库及本地中药成分数据库OTCML，将提取得到的分子离子色谱峰、同位素峰拟合出可能的分子式，与特征碎片离子信息实测谱图进行匹配。对匹配出的结果设置过滤参数：峰面积阈值80 000，一级及二级质量偏差不得大于5×10-6，匹配度分值高于80，从而初步筛选得出明日叶中可能存在的化合物。对筛选得到的离子及数据库中的化合物信息与相关文献或对照品进行比对，进行化合物分析鉴定[15]。

3 结果

3.1 UPLC-Q-Orbitrap HRMS分析结果

取上述供试品溶液，按“2.2项下条件”对明日叶甲醇提取液在正离子模式下的总离子流色谱见图1；在负离子模式下的总离子流色谱见图2。在正、负离子模式下，供试品溶液分离效果及离子化效率良好。

图1 明日叶甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正离子模式总离子流色谱

图2 明日叶甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS负离子模式总离子流色谱

3.2 UPLC-Q-Orbitrap HRMS鉴定结果

本实验从明日叶中共鉴定了68个化合物，包含12个查尔酮类，17个黄酮类，18个香豆素类，1个萜类，2个寡糖类，5个氨基酸类，6个有机酸类，7个其他类化合物，其中34个成分首次从明日叶中鉴定得到。对明日叶甲醇提取液进行正离子模式分析鉴定的成分见表1；负离子模式分析鉴定的成分见表2。

表1 明日叶甲醇提取液UPLC-Q-Orbitrap HRMS正离子模式总离子流色谱

表2 明日叶甲醇提取物UPLC-Q-Orbitrap HRMS负离子模式数据及成分鉴定

3.3 UPLC-Q-Orbitrap HRMS化学成分的质谱解析

3.3.1 查尔酮类化合物的裂解特征 查尔酮类化合物是明日叶主要活性成分[5]。本实验从明日叶甲醇提取液中共鉴定了12个查尔酮类化合物，包括7种黄色当归醇以及其他5种查尔酮苷元。在质谱碎裂过程中，查尔酮类化合物的断裂方式主要发生RDA裂解和丢失HCHO等中性离子。以化合物39为例，正离子模式下形成质子化准分子离子[M+H]+m/z339.1593，预测其分子式为C21H22O4，在二级质谱中可见其发生RDA裂解，形成碎片离子[M+H-C4H8]+m/z283.096 6，[1，3A+H]+m/z181.049 7，[1，4B+H]+m/z163.039 1，[1，4B+H-HCHO]+m/z133.028 6。根据化合物的二级质谱裂解特征，经数据库检索并与文献比对，推断其为4-羟基德里辛，裂解规律见图3。

图 3 4-羟基德里辛质谱裂解途径

3.3.2 黄酮类化合物裂解特征 黄酮类化合物在植物界分布广泛[2]，在植物体内其大部分与糖结合成苷类或以碳糖基的形式存在，也有以游离形式存在的。本实验从明日叶甲醇提取液中共鉴定了17个黄酮类化合物，包括8种黄酮苷及9种黄酮苷元，其中，甘草素经与对照品比对而准确鉴定。黄酮类化合物在质谱条件下的断裂方式主要有CO、CO2、H2O等中性离子丢失与1，3A+、0，2A+、1，3B+、0，2B+等RDA裂解及糖基的断裂[16]。以化合物23为例，正离子模式下形成质子化准分子离子[M+H]+m/z257.080 9，预测其分子式为C15H12O4，在二级质谱中可见其发生RDA裂解，形成碎片离子[1，4B-H2+H]+m/z147.044 2，[1，3A+H]+m/z137.023 5，[1，4B-H2+H-CO]+m/z119.049 5。根据化合物的二级质谱裂解特征，经数据库检索及与对照品保留时间比对，鉴定其为甘草素，裂解规律见图4。

图 4 甘草素质谱裂解途径

3.3.3 香豆素类化合物的裂解特征 香豆素类化合物是明日叶的药效成分之一[2]。本实验从明日叶甲醇提取液中共鉴定了18个香豆素类化合物，包括4种简单香豆素，8种线性香豆素，2种角型呋喃香豆素，2种线性吡喃香豆素和2种角型吡喃香豆素。香豆素类化合物由于有较好的共轭系统，在ESI电喷雾质谱中，其断裂方式主要有CO、CO2等中性离子的丢失。例如：化合物18在正离子模式下形成质子化准分子离子[M+H]+m/z305.102 1，预测其分子式为C16H16O6，二级质谱中可见[M+H-C5H10O2]+m/z203.033 9，[M+H-C5H10O2-CO-CO]+m/z147.044 2，[M+H-C5H10O2-CO-CO2]+m/z131.049 4。根据化合物的二级质谱裂解特征，经过数据库检索及与对照品保留时间比对，鉴定其为水合氧化前胡素，裂解规律见图5。

图5 水合氧化前胡素质谱裂解途径

3.3.4 萜类化合物的裂解特征 明日叶中萜类成分也具有药理作用[2]。本实验从明日叶中鉴定了1个萜类化合物，化合物35在正离子模式下形成质子化准分子离子[M+H]+m/z235.169 4，预测其分子式为C15H22O2，二级质谱中可见[M+H-O]+m/z219.137 5，[M+H-O-C3H4]+m/z179.106 8。根据化合物的二级质谱裂解特征，经过数据库检索及与文献比对，推断其为Ashitabaol A，裂解规律见图6。

图 6 Ashitabaol A质谱裂解途径

3.3.5 寡糖类化合物的裂解特征 本实验从明日叶中共鉴定了2个寡糖类化合物。寡糖类二级质谱裂解特征主要为丢失H2O。以化合物43为例，负离子模式下形成准分子离子[M-H]-m/z341.108 9，预测其分子式为C12H22O11，二级质谱中可见[M-H-C6H10O5]-m/z179.055 6，[M-H-C6H10O5-H2O]-m/z161.044 9，根据化合物的二级质谱裂解特征，经过数据库检索及与对照品保留时间比对，鉴定其为蔗糖，裂解规律见图7。

图7 蔗糖质谱裂解途径

3.3.6 氨基酸类化合物的裂解特征 本实验从明日叶中共鉴定了5个氨基酸类化合物。二级质谱裂解特征主要为丢失NH3、HCOOH中性离子。以化合物4为例，正离子下可形成质子化准分子离子[M+H]+m/z166.086 2，预测其分子式为C9H11NO2，二级质谱中可见[M+H-NH3]+m/z149.059 7，[M+H-HCOOH]+m/z120.081 0，[M+H-NH3-HCOOH]+m/z103.0547，根据化合物的二级质谱裂解特征，经过数据库检索及与文献[17]比对，推断其为苯丙氨酸，裂解规律见图8。

图8 苯丙氨酸质谱裂解途径

3.3.7 有机酸类化合物的裂解特征 本实验从明日叶中共鉴定了6个有机酸类化合物，二级质谱裂解特征主要丢失H2O、CO2中性离子。例如，化合物58在负离子模式下形成准分子离子[M-H]-m/z201.112 7，预测其分子式为C10H18O4，二级质谱中可见[M-H-H2O]-m/z183.102 1，[M-H-H2O-CO2]-m/z139.112 0，根据化合物的二级质谱裂解特征，经数据库检索及与文献[18]比对，推断其为癸二酸，裂解规律见图9。

图9 癸二酸质谱裂解途径

4 结论

本实验基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS技术，选择流动相0.1%甲酸溶液-甲醇梯度洗脱，并对明日叶中的化学成分进行了分析鉴定。通过比较明日叶中的化合物在正、负离子模式下的总离子流图，发现正、负离子模式下均有较好的响应，较为全面地阐明了明日叶的化学物质基础，可为其质量评价及药效物质基础研究提供理论依据和方法学参考。

从鉴定结果看，本实验从明日叶中初步鉴定了68个化合物，其化学成分大致分为7大类，其中查尔酮类、黄酮类、香豆素类成分具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病、降血压、降胆固醇和改善神经系统功能等药理活性[5]，提示明日叶极具开发前景。与已报道的明日叶化学成分研究相比，34个成分首次从明日叶中鉴定得到，进一步丰富、完善了明日叶的化学成分库。此外，已鉴定的花椒毒素、美洲花椒素、佛手酚和丝立尼亭等香豆素类化合物，葛根素等黄酮类化合物质谱响应值高，且这些化合物分别具有降糖、抗炎[25]、防癌[26]等药理活性，可考虑作为明日叶质量评价的候选指标。