基于网络药理学的清爽膏治疗银屑病的作用机制研究Δ

李 洋，张林华，曾祖平

(1.首都医科大学附属北京中医医院药学部，北京 100010；2.北京市临床药学研究所成果转化促进中心，北京 100035；3.北京市中医研究所中药室，北京 100010)

清爽膏是首都医科大学附属北京中医医院的院内制剂(批准文号：京药制字Z20073002)，由紫草、大黄和当归3味中药组成，功效为清热解毒、凉血止痛，在临床上用于血热毒盛证，外用治疗局部潮红、灼痛、烫冻伤清洁疮面和银屑病等。网络药理学是基于系统生物学理论，利用网络分析方法，通过整体观的角度探讨药物、靶点和疾病间相互作用的药理学分支学科。网络药理学通过对药物分子、作用靶点及其疾病相关靶点等资料进行收集、分析，并利用计算机软件构建出“药物-靶点-疾病”间的相互关联网络。网络药理学具有整体性、系统性等特点，与中医药整体观、辨证论治的理论相一致，近年来已被广泛用于中药潜在活性成分的确认及其作用靶点的预测，以及中药复方制剂的作用机制研究[1-5]。基于网络药理学方法，本研究对清爽膏治疗银屑病的可能机制进行了探讨，以期为揭示清爽膏的药效物质基础和潜在的作用靶点奠定基础，为进一步研究其作用机制提供依据。

1 资料与方法

1.1 清爽膏活性成分检索及作用靶点的筛选

以紫草、大黄和当归为关键词，在中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)上检索清爽膏中3味中药所含的化学成分。以类药性(DL)≥0.18为筛选条件，优选出各味中药潜在的化学成分；再通过化学成分检索到相应的靶点，借助于Uniprot数据库查询出靶标蛋白对应的基因名称。

1.2 疾病靶点的筛选

在GeneCards数据库中以“psoriasis”为关键词进行检索，筛选出与银屑病相关的疾病靶点基因信息。

1.3 疾病与药物共同靶点的筛选

将清爽膏中优选出的化学成分靶点及银屑病相关疾病靶点，输入到在线软件作图工具平台(http://www.bioinformatics.com.cn)中绘制韦恩图，两者的交集即可认为是“疾病-化学成分”的共同靶点。

1.4 “药物-成分-靶点”网络的构建

基于银屑病靶点与清爽膏中活性成分靶点之间的相互作用关系，通过Cytoscape 3.7.0软件构建“药物-成分-靶点”网络。

1.5 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络的建立

将筛选出的交集靶点基因导入String数据库中，分析靶基因间的蛋白质相互作用，“Homo sapiens”为限定的物种，将置信度设定为“>0.4”，以代表两个蛋白间具有相互作用关系，进而构建药物化学成分靶点和银屑病靶点的PPI网络。并将结果导入到Cytoscape 3.7.0软件中，再以网络中各靶基因节点的连接度值(Degree)作为指标，开展拓扑异构学的分析，以期筛选出网络中的核心蛋白质靶标。

1.6 靶点基因本体(GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析

依托DAVID数据库对共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路分析，并借助于Omicshare软件(https://www.omicshare.com/tools/)对所得结果展开可视化的处理。

2 结果

2.1 清爽膏活性成分及作用靶点

检索TCMSP，筛选得到清爽膏的活性成分108种，去除部分没有靶点的化合物，得到62个化合物，以ID进行排序后，前5个化合物分别为儿茶素[(-)-catechin]、齐墩果酸(oleanolic acid)、长柄扁豆(sitoglusidebeta-sitostero)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)和谷甾醇(sitosterol)。在此基础上进一步查找清爽膏中有效/活性成分的靶点，筛选后共得到150个靶点蛋白。在UniProt数据库中输入上述靶点蛋白，并查询其所对应的靶点简称，最终获得127个靶点基因。

2.2 疾病靶点

在GeneCards数据库中筛选得到与银屑病相关的疾病靶点基因共3 881条。

2.3 药物与疾病靶点的交集

通过在线软件作图工具平台(http://www.bioinformatics.com.cn)，绘制清爽膏中127个靶点基因以及银屑病相关3 881个靶点基因的韦恩图，两者的交集认定为“疾病-化学成分”的共同作用靶点，共82个，见图1。

图1 银屑病与清爽膏成分靶点的韦恩图

2.4 “药物-成分-靶点”网络

通过Cytoscape 3.7.0软件构建清爽膏“药物-成分-靶点”网络，见图2。图中共包含130个节点，310条相互作用关系。清爽膏中作用于银屑病的化学成分有45个，Degree排序居前5位的化合物为熊果酸(ursolic acid)、大黄素(emodin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)和芦荟大黄素(aloe-emodin)，其中，熊果酸为紫草含有的成分，β-谷甾醇为当归、大黄共有的成分，大黄素、芦荟大黄素为大黄含有的成分，豆甾醇是当归含有的成分；化合物与疾病共同作用靶点82个，Degree排序居前5位的靶点为PTGS2、PTGS1、ESR1、NCOA1和CA2，见表1。

菱形代表中药，矩形代表化合物，椭圆形代表靶点

表1 清爽膏“药物-成分-靶点”网络拓扑图分析表

2.5 PPI网络的建立

利用String数据库，将筛选出的清爽膏作用靶点与银屑病相关靶点的交集靶点基因导入其中，对靶基因间的PPI进行分析，构成“药物化学成分靶点-银屑病靶点”的PPI网络图，见图3。网络中共有82个节点，1 036条边；图中的节点表示蛋白质的靶点，每条边表示PPI关系。将其导入Cytoscape 3.7.0软件进行拓扑异构学分析，并绘制Degree排序居前20位的靶点柱状图，见图4。Degree排序居前5位的靶点分别为白细胞介素6(IL-6)、肿瘤抑制蛋白p53(TP53)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、肿瘤坏死因子(TNF)、信号传导蛋白和转录激活物(STAT3)。

图3 清爽膏与银屑病共同靶点PPI网络图

图4 Degree排序居前20位的靶点柱状图

2.6 GO功能富集分析

依托DAVID平台进行GO功能富集分析，总共得到501条数据，将错误发现率(FDR)<0.05作为标准，最终得到203条数据。其中，152个条目与生物过程相关，32个条目与分子功能相关，19个条目与细胞组成相关。表2列举了前20条(以FDR从小到大排序)显著的富集通路，主要涉及转录调控、凋亡过程和血管生成等。

表2 清爽膏PPI网络中的GO条目

2.7 KEGG通路富集分析

依托DAVID平台进行通路富集分析，以P<0.01、FDR<0.05作为条件进行筛选，共得81条结果，将结果通过Omicshare软件进行可视化。根据P值，选取前20个条目展示，见图5。信号通路主要包括乙型肝炎、癌症的途径、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路、结直肠癌、MAPK信号通路、p53信号通路和血管内皮生长因子信号通路等。

图5 KEGG通路富集的气泡图

3 讨论

银屑病是一种慢性炎症性皮肤病，以表皮增厚、免疫反应和血管增生为特点。研究结果表明，银屑病的发生发展过程与免疫功能失调、信号转导通路紊乱、血管损伤和相关基因表达均有一定的相关性[6-7]。现代医学治疗银屑病主要的药物包括保湿剂、润肤剂、糖皮质激素、维生素D3衍生物和钙调磷酸酶抑制剂等，但不良反应较多，无法长期使用[8]。中医药治疗银屑病历史悠久，疗效确切，能够改善病情，延长缓解期，具有不良反应小的特点。清爽膏来源于赵炳南的临床经验方“清凉膏”[9]。清爽膏由大黄、当归和紫草3味中药组成，其中大黄清热泻火、凉血解毒；当归补血活血；紫草清热凉血、活血解毒、透疹消斑。3味药组合，具有清热凉血、活血解毒的作用，对银屑病的治疗有一定的疗效。

本研究中，“药物-成分-共同靶点”网络图共获得45个清爽膏作用于银屑病的核心成分，以及对应的82个核心调控靶点。核心成分中最关键的成分包括熊果酸、大黄素、芦荟大黄素、β-谷甾醇和豆甾醇。β-谷甾醇参与炎症反应，同时可以减少TNF、IL-6和IL-1β的释放，并据此改善银屑样的特征性皮损[10-11]。芦荟大黄素具有抗炎的功效，能降低IL-6和TNF-α水平；能增加皮肤及皮肤血管相关生长因子的表达水平，促进创面愈合；能显著抑制人胶质细胞增殖且诱导角质细胞凋亡；还能增强巨噬细胞的吞噬作用，诱导IL-1β增强机体免疫[12]。

“药物-共同靶点-疾病”网络显示，Degree排序居前5位的靶点分别为PTGS2、PTGS1、ESR1、NCOA1和CA2，其中被药物调控最多的作用靶点为PTGS2，PTGS1、ESR1次之。前列腺素是一类具有生理活性的不饱和脂肪酸，参与介导细胞增殖、分化和凋亡等一系列细胞活动，参与炎症、恶性肿瘤和心血管疾病等多种病理过程。其中，PTGS2参与前列腺素的合成，是前列腺素合成过程中的一种关键酶[13]。ESR1是雌激素受体，可调节脂肪组织的VEGFA，增强血管生成，减少炎症和改善脂肪组织功能[1]。

本研究构建的PPI网络图显示，清爽膏治疗银屑病的关键靶点包括IL-6、TP53、VEGFA、TNF、STAT3、PTGS2、CASP3、JUN和MAPK8。IL-6是一种多功能的促炎因子，在银屑病的发生发展中发挥重要作用，通过多条信号通路激活其受体，可对细胞的增殖、分化和凋亡等多种生理过程产生影响[14]。TNF由活化的巨噬细胞、自然杀伤细胞及淋巴细胞产生，具有广泛生物活性的细胞因子。TNF参与了众多疾病的发生和发展，如肿瘤、感染、发热、内毒素性休克和自身免疫性疾病等。TNF能促使炎症因子的合成与释放，可能与银屑病的炎症反应有关[15]。银屑病的炎症过程主要通过树突状细胞DCs和T细胞介导，其与角质形成细胞KCs相互作用，使病灶部位皮肤出现表皮角化过度伴角化不全、淋巴细胞大量浸润和广泛血管生成的组织病理学特征。主要参与的关键靶点为TNF、IL-17A、IL-12和IL-23[16]。

为了对共同作用靶点的机制作用进行深入探索，本研究开展了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析结果显示，共同靶点的基因功能主要集中在细胞的增殖调控、基因的表达调控、细胞对缺氧的反应以及细胞凋亡调控等生物过程。通过KEGG信号通路分析可知，共同靶点作用通路包括HIF-1信号通路、TNF信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、血管内皮生长因子信号通路和p53信号通路等。HIF-1缺氧诱导因子是一种转录因子，缺氧条件下存在于人体内，是应答缺氧应急的关键因子，HIF-1α是HIF-1的一个亚单位，在银屑病皮损中高表达，可诱导血管内皮生长因子表达，促进血管生长和表皮角质层过度增殖[17]。PI3K/AKT信号通路参与了细胞的增殖、分化和凋亡等过程，并参与表皮细胞的分化和存活过程[10]。p53信号通路是DNA损伤后介导细胞周期阻滞的关键路径，其异常可导致细胞凋亡或过度增殖。银屑病是一种具有特征性细胞过度增殖的慢性炎症性皮肤病，发病时可以检测到p53表达增多[18]。该通路涉及的靶点有CASP9、CDKN1A、CCNB1、CASP3、CASP8、BAX和TP53。有研究结果表明，银屑病角质形成细胞与CASP3活性有一定的相关性，可以增加CASP3蛋白表达。CASP3是一种细胞凋亡标志物，可以反应银屑病的进展情况。MAPK是一种丝氨酸蛋白激酶，是能够接受各种有丝分裂原刺激而活化的一种蛋白激酶。有研究结果表明，银屑病患者皮损中MAPK的活性明显增高，可能是由于高水平的生长因子使MAPK过度激活，从而参与了银屑病表皮细胞过度增殖的调节[19]。

综上所述，本研究利用网络药理学分析方法，探讨清爽膏通过多成分、多途径、多靶点治疗银屑病的作用机制，明确了清爽膏中核心化学成分的组成，分析了清爽膏治疗银屑病的机制与IL-6、MAPK、TNF、CASP3、PTGS2、PTGS1和ESR1靶点的相关性强，与HIF-1信号通路、PI3K-Akt信号通路、p53信号通路、MAPK信号通路和血管内皮生长因子信号通路有关，为进一步研究清爽膏治疗银屑病的作用机制提供了思路，但仍需实验验证。