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缺氧对人肺动脉平滑肌细胞内活性氧及细胞色素C的影响及意义

2022-02-21张建银李丹丹

宁夏医学杂志 2022年1期
关键词:常氧组平滑肌肺动脉

陈 乾,沈 乐,杨 静,张建银,耑 冰,赵 霞,李丹丹,董 辉

近年来,随着超声心动图的普及,肺动脉高压已成为呼吸内科的常见临床症状。而慢性阻塞性肺疾病(COPD)被认为是发生肺动脉高压的重要原因之一。在COPD形成肺动脉高压的病理过程中,缺氧是形成肺动脉高压的中心环节[1]。本研究利用前期培养的人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs),建立缺氧模型,进而观察缺氧对hPASMCs细胞内活性氧(ROS)及细胞色素C(Cyt-C)的影响,为进一步寻找干预COPD相关性肺动脉高压的治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品:人肺动脉平滑肌细胞(2018年购自上海武光生物科技有限公司,于宁夏医科大学总医院科研中心实验室复苏)、胰蛋白酶、胎牛血清、CCK-8试剂盒(上海李记生物)、DCFH-DA分子试剂(上海翊圣生物)、Trizol试剂(南京凯基)、ROS检测试剂盒(上海翊圣生物)、全蛋白提取试剂盒(南京凯基)、蛋白含量检测试剂盒(南京凯基)、反转录试剂盒(大连宝生物)、人抗鼠细胞色素C一抗(北京博奥森)、鼠抗兔二抗(北京博奥森)。

1.2 主要仪器设备:标准培养箱、4 ℃低温离心机、PCR仪(BIO-RAD MyCycler)、凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)、荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)、酶标仪(Bio-Tek ELx800)、湿电转膜仪(BIO-RAD)、激光共聚焦显微镜。

1.3 实验对象及分组:将前述购买的hPASMCs以慢性缺氧条件培养的hPASMCs为实验对象。分组:根据hPASMCs的培养条件不同,分为常氧组(即空白对照组)和缺氧组;其中常氧组hPASMCs的培养条件为:hPASMCs在标准培养箱(37 ℃,21%O2,5%CO2)中培养;缺氧组培养条件为:hPASMCs在标准培养箱(37℃,1% O2,5% CO2,94% N2)中培养。

1.4 2组细胞培养及细胞增殖的检测:分别将以上2组hPASMCs,以1×104/mL细胞数培养于25 mL培养瓶中,培养24 h后再同步培养24 h,以每组1×104/mL的细胞数分别培养于5 mL培养皿中,按照前述条件,2组hPASMCs分别在常氧及缺氧条件下培养72 h,分别在培养开始计时后的1、24、48及72 h使用CCK-8试剂盒分别检测2组hPASMCs的增殖情况。

1.5 2组hPASMCs内ROS水平检测:在1.4步骤中所确定的时间点,分别取生长状态良好、对数生长期的2组hPASMCs,经离心(500 g,5 min)后收集单细胞悬液,PBS冲洗,弃上清,PBS重悬后,在样品中加入10μM DCFH-DA,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗,荧光显微镜下观测细胞内ROS水平,激发光波长495 nm,发射光波长515 nm。

1.6 Westernblot检测Cyt-C表达水平:在1.4中所确定的时间点分别获取2组hPASMCs,裂解细胞,制备细胞匀浆后,使用全蛋白提取试剂盒提取匀浆中全蛋白,行BCA蛋白定量,取样,经过上样(上样量40 μg)、电泳、转膜、封闭、滴加抗人鼠细胞色素C一抗(一抗稀释度1∶3 000,4 ℃)摇晃12 h,PBST转膜15 min,3次,滴加生物素标记二抗,4 ℃摇晃3 h,PBST洗膜后行ECL发光,胶片曝光,使用凝胶成像系统进行灰度分析,分别测定2组hPASMCs内Cyt-C蛋白条带光密度值及β-actin条带光密度值,以Cyt-C条带光密度值及β-actin条带光密度值作为Cyt-C表达的相对值。

2 结果

2.1 缺氧对2组hPASMCs增殖的影响:2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中,其细胞增殖水平OD值差异有统计学意义(P<0.05);缺氧组内不同时间点细胞增殖水平相比,其差异有统计学意义(P<0.05);提示随着缺氧时间延长,缺氧组hPASMCs增殖水平亦明显升高,见表1。

表1 2组hPASMCs不同时点增殖及细胞内ROS水平

2.2 2组hPASMCs内ROS水平比较:2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中,其细胞内ROS荧光OD值差异有统计学意义(P<0.05);缺氧组内不同时间点ROS荧光OD值相比,其差异有统计学意义(P<0.05),见表1。提示随着缺氧时间延长,缺氧组hPASMCs内ROS水平逐步升高,而常氧组内ROS水平无明显变化,见图1(封三)。

2.3 2组hPASMCs内Cyt-C的表达 2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中,其内细胞色素C的表达相对值分别为:缺氧组(0.516±0.029、0.673±0.060、0.981±0.135和1.180±0.131)、常氧组(0.509±0.063、0.488±0.023、0.534±0.016和0.512±0.033),2组hPASMCs内Cyt-C的表达相对值差异有显著性(P<0.05);缺氧组内不同时间点Cyt-C的表达水平相比,其差异有统计学意义(P<0.05),提示随着缺氧时间延长,缺氧组hPASMCs内Cyt-C水平逐步升高,见图2(封三)。

3 讨论

目前,COPD相关肺动脉高压危害巨大。中外学者研究均表明[2-3],COPD合并肺动脉压力超过40 mmHg的患者,其3年生存率将低至33%,故积极寻找干预肺动脉高压形成的作用靶点非常必要。在肺动脉高压形成的病理过程中,缺氧被认为是肺动脉高压形成的中心环节[1]。而缺氧导致肺动脉高压的形成机制极为复杂,涉及多种细胞因子分泌失衡、钙离子通道功能障碍、信号通路异常激活等多个环节[4],故目前相关机制不是非常明确,仍需进一步研究。

众所周知,在培养基中培养的细胞,细胞的增殖和凋亡是同时存在的。只有细胞增殖水平大于细胞凋亡,培养基中细胞数目才可能增加,反之细胞将减少。本课题组分别在常氧条件和缺氧条件下对hPASMCs进行连续培养,结果发现,缺氧条件下的hPASMCs可出现明显增殖,这个结果同国内张昱等人[5]的研究类似。张昱等人发现,大鼠肺动脉平滑肌在缺氧条件下可出现明显增殖,这种增殖的基础系肺动脉平滑肌细胞的增殖增加,同时伴有凋亡减少,从而肺动脉平滑肌细胞表现为数量的绝对增加;另外,hPASMCs数量的增加也成为肺动脉血管重构,并最终导致肺动脉高压形成的细胞基础[6]。

ROS是由细胞线粒体内电子传递链复合体Ⅲ产生的一种高能小分子。Archer SL研究发现[6],低氧条件下,线粒体释放大量ROS至细胞质,从而激活一系列转录和翻译的后适应反应。而本研究的结果与Archer SL的研究类似,在缺氧条件下培养的hPASMCs,其内ROS随缺氧时间延长而增加,而在常氧条件下培养的hPASMCs,其内ROS水平基本无变化。这不仅提示了缺氧可导致hPASMCs内大量ROS的产生,也反映了hPASMCs内线粒体膜通透性的损伤;本研究结果也表明缺氧72 h后,hPASMCs内ROS荧光水平显著升高。

细胞凋亡是健康生物体通过消除不良和(或)多余细胞的重要方式,而线粒体介导的凋亡途径就是触发细胞凋亡的重要方式之一[7]。研究发现[7-10],在线粒体途径中,当ROS大量形成并损伤线粒体膜以后,Cyt-C从线粒体通透性转换孔漏出,参与形成凋亡复合多聚体复合物,并同Bcl-2家族蛋白一起进一步触发Caspase8/9激活,并启动Caspase3/7,并最终启动凋亡程序。而在本研究中,我们发现了类似的趋势,即随着缺氧时间延长,ROS水平升高,线粒体膜损伤,通透性升高,Cyt-C进入细胞浆增多,从而出现了Cyt-C表达水平随缺氧时间延长而不断增多的现象。

综上所述,我们推断缺氧可导致hPASMCs内线粒体ROS生成增加,从而损伤线粒体膜,线粒体膜通透性增加,Cyt-C进入细胞质导致hPASMCs的凋亡不断增加,进而使得hPASMCs的增殖/凋亡水平比值逆转,hPASMCs将出现先增多后减少的趋势,从而出现了肺动脉血管的重构,并最终导致了肺动脉高压的形成。故细胞内ROS水平及Cyt-C水平均可成为阻止肺动脉高压形成的潜在靶点。虽然如此,缺氧对线粒体内ROS及Cyt-C影响的详细机制仍有待于进一步研究。

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