缺氧对人肺动脉平滑肌细胞内活性氧及细胞色素C的影响及意义

陈 乾，沈 乐，杨 静，张建银，耑 冰，赵 霞，李丹丹，董 辉

近年来，随着超声心动图的普及，肺动脉高压已成为呼吸内科的常见临床症状。而慢性阻塞性肺疾病(COPD)被认为是发生肺动脉高压的重要原因之一。在COPD形成肺动脉高压的病理过程中，缺氧是形成肺动脉高压的中心环节[1]。本研究利用前期培养的人肺动脉平滑肌细胞(hPASMCs)，建立缺氧模型，进而观察缺氧对hPASMCs细胞内活性氧(ROS)及细胞色素C(Cyt-C)的影响，为进一步寻找干预COPD相关性肺动脉高压的治疗靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品:人肺动脉平滑肌细胞(2018年购自上海武光生物科技有限公司，于宁夏医科大学总医院科研中心实验室复苏)、胰蛋白酶、胎牛血清、CCK-8试剂盒(上海李记生物)、DCFH-DA分子试剂(上海翊圣生物)、Trizol试剂(南京凯基)、ROS检测试剂盒(上海翊圣生物)、全蛋白提取试剂盒(南京凯基)、蛋白含量检测试剂盒(南京凯基)、反转录试剂盒(大连宝生物)、人抗鼠细胞色素C一抗(北京博奥森)、鼠抗兔二抗(北京博奥森)。

1.2 主要仪器设备:标准培养箱、4 ℃低温离心机、PCR仪(BIO-RAD MyCycler)、凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)、荧光定量PCR仪(美国罗氏公司)、酶标仪(Bio-Tek ELx800)、湿电转膜仪(BIO-RAD)、激光共聚焦显微镜。

1.3 实验对象及分组:将前述购买的hPASMCs以慢性缺氧条件培养的hPASMCs为实验对象。分组：根据hPASMCs的培养条件不同，分为常氧组(即空白对照组)和缺氧组；其中常氧组hPASMCs的培养条件为：hPASMCs在标准培养箱(37 ℃，21%O2，5%CO2)中培养；缺氧组培养条件为：hPASMCs在标准培养箱(37℃，1% O2，5% CO2，94% N2)中培养。

1.4 2组细胞培养及细胞增殖的检测:分别将以上2组hPASMCs，以1×104/mL细胞数培养于25 mL培养瓶中，培养24 h后再同步培养24 h，以每组1×104/mL的细胞数分别培养于5 mL培养皿中，按照前述条件，2组hPASMCs分别在常氧及缺氧条件下培养72 h，分别在培养开始计时后的1、24、48及72 h使用CCK-8试剂盒分别检测2组hPASMCs的增殖情况。

1.5 2组hPASMCs内ROS水平检测:在1.4步骤中所确定的时间点，分别取生长状态良好、对数生长期的2组hPASMCs，经离心(500 g，5 min)后收集单细胞悬液，PBS冲洗，弃上清，PBS重悬后，在样品中加入10μM DCFH-DA，37 ℃孵育30 min，PBS冲洗，荧光显微镜下观测细胞内ROS水平，激发光波长495 nm,发射光波长515 nm。

1.6 Westernblot检测Cyt-C表达水平:在1.4中所确定的时间点分别获取2组hPASMCs，裂解细胞，制备细胞匀浆后，使用全蛋白提取试剂盒提取匀浆中全蛋白，行BCA蛋白定量，取样，经过上样(上样量40 μg)、电泳、转膜、封闭、滴加抗人鼠细胞色素C一抗(一抗稀释度1∶3 000，4 ℃)摇晃12 h，PBST转膜15 min，3次，滴加生物素标记二抗，4 ℃摇晃3 h，PBST洗膜后行ECL发光，胶片曝光，使用凝胶成像系统进行灰度分析，分别测定2组hPASMCs内Cyt-C蛋白条带光密度值及β-actin条带光密度值，以Cyt-C条带光密度值及β-actin条带光密度值作为Cyt-C表达的相对值。

2 结果

2.1 缺氧对2组hPASMCs增殖的影响：2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中，其细胞增殖水平OD值差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧组内不同时间点细胞增殖水平相比，其差异有统计学意义(P<0.05)；提示随着缺氧时间延长，缺氧组hPASMCs增殖水平亦明显升高，见表1。

表1 2组hPASMCs不同时点增殖及细胞内ROS水平

2.2 2组hPASMCs内ROS水平比较:2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中，其细胞内ROS荧光OD值差异有统计学意义(P<0.05)；缺氧组内不同时间点ROS荧光OD值相比，其差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。提示随着缺氧时间延长，缺氧组hPASMCs内ROS水平逐步升高，而常氧组内ROS水平无明显变化，见图1(封三)。

2.3 2组hPASMCs内Cyt-C的表达 2组hPASMCs在1、24、48及72 h的培养过程中，其内细胞色素C的表达相对值分别为：缺氧组(0.516±0.029、0.673±0.060、0.981±0.135和1.180±0.131)、常氧组(0.509±0.063、0.488±0.023、0.534±0.016和0.512±0.033)，2组hPASMCs内Cyt-C的表达相对值差异有显著性(P<0.05)；缺氧组内不同时间点Cyt-C的表达水平相比，其差异有统计学意义(P<0.05)，提示随着缺氧时间延长，缺氧组hPASMCs内Cyt-C水平逐步升高，见图2(封三)。

3 讨论

目前，COPD相关肺动脉高压危害巨大。中外学者研究均表明[2-3]，COPD合并肺动脉压力超过40 mmHg的患者，其3年生存率将低至33%，故积极寻找干预肺动脉高压形成的作用靶点非常必要。在肺动脉高压形成的病理过程中，缺氧被认为是肺动脉高压形成的中心环节[1]。而缺氧导致肺动脉高压的形成机制极为复杂，涉及多种细胞因子分泌失衡、钙离子通道功能障碍、信号通路异常激活等多个环节[4]，故目前相关机制不是非常明确,仍需进一步研究。

众所周知，在培养基中培养的细胞，细胞的增殖和凋亡是同时存在的。只有细胞增殖水平大于细胞凋亡，培养基中细胞数目才可能增加，反之细胞将减少。本课题组分别在常氧条件和缺氧条件下对hPASMCs进行连续培养，结果发现，缺氧条件下的hPASMCs可出现明显增殖，这个结果同国内张昱等人[5]的研究类似。张昱等人发现，大鼠肺动脉平滑肌在缺氧条件下可出现明显增殖，这种增殖的基础系肺动脉平滑肌细胞的增殖增加，同时伴有凋亡减少，从而肺动脉平滑肌细胞表现为数量的绝对增加；另外，hPASMCs数量的增加也成为肺动脉血管重构，并最终导致肺动脉高压形成的细胞基础[6]。

ROS是由细胞线粒体内电子传递链复合体Ⅲ产生的一种高能小分子。Archer SL研究发现[6]，低氧条件下，线粒体释放大量ROS至细胞质，从而激活一系列转录和翻译的后适应反应。而本研究的结果与Archer SL的研究类似，在缺氧条件下培养的hPASMCs，其内ROS随缺氧时间延长而增加，而在常氧条件下培养的hPASMCs，其内ROS水平基本无变化。这不仅提示了缺氧可导致hPASMCs内大量ROS的产生，也反映了hPASMCs内线粒体膜通透性的损伤；本研究结果也表明缺氧72 h后，hPASMCs内ROS荧光水平显著升高。

细胞凋亡是健康生物体通过消除不良和(或)多余细胞的重要方式，而线粒体介导的凋亡途径就是触发细胞凋亡的重要方式之一[7]。研究发现[7-10]，在线粒体途径中，当ROS大量形成并损伤线粒体膜以后，Cyt-C从线粒体通透性转换孔漏出，参与形成凋亡复合多聚体复合物，并同Bcl-2家族蛋白一起进一步触发Caspase8/9激活，并启动Caspase3/7，并最终启动凋亡程序。而在本研究中，我们发现了类似的趋势，即随着缺氧时间延长，ROS水平升高，线粒体膜损伤，通透性升高，Cyt-C进入细胞浆增多，从而出现了Cyt-C表达水平随缺氧时间延长而不断增多的现象。

综上所述，我们推断缺氧可导致hPASMCs内线粒体ROS生成增加，从而损伤线粒体膜，线粒体膜通透性增加，Cyt-C进入细胞质导致hPASMCs的凋亡不断增加，进而使得hPASMCs的增殖/凋亡水平比值逆转，hPASMCs将出现先增多后减少的趋势，从而出现了肺动脉血管的重构，并最终导致了肺动脉高压的形成。故细胞内ROS水平及Cyt-C水平均可成为阻止肺动脉高压形成的潜在靶点。虽然如此，缺氧对线粒体内ROS及Cyt-C影响的详细机制仍有待于进一步研究。