饲料中添加芽孢杆菌对黄鳝肠道菌群和免疫功能的影响

张新明，张玉红，刘 明

（湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌 443000）

黄鳝是我国淡水养殖中的重要水产动物，具有丰富的营养成分和经济价值。随着黄鳝需求量不断加大，导致黄鳝养殖密度增加，抗生素广泛使用，造成黄鳝养殖环境发生变化，使黄鳝幼苗频频发病，频繁病害给黄鳝养殖户带来了巨大的经济损失，严重影响黄鳝养殖业的健康发展（谭凤霞等，2020）。黄鳝发病期间频繁消毒和用药给水体环境带来巨大的危害，黄鳝机体会对药物产生耐药性和药物残留。因此，找到一种稳定、抗病力强、环保、高效的饲料添加剂替代抗生素十分必要。而益生菌是一类保持动物体内微生物种类平衡，显著提高动物生长速率，增强动物免疫机能的微生态制剂。益生菌对动物没有毒副作用，具有提高动物生长速率，改善动物肠道菌群，促进动物对饲料的消化吸收，提高机体免疫功效等特点，已成为替代抗生素的微生态制剂（杨明容等，2017；粟雄高等，2012）。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类益生菌，能抵御高温环境，抗酸碱腐蚀和稳定生物活性。枯草芽孢杆菌在动物肠道内消耗内部氧气，并产生酸性物质，营造一种厌氧酸性环境，具有改善益生菌生存环境，降低有害菌浓度，保持肠道菌群稳定，增加肠绒毛面积，促进肠道多种消化酶的分泌，维持各类消化酶活性，提高动物对营养物质的吸收利用效率，有利于动物增重，增强动物免疫机能（沈斌乾等，2013）。枯草芽孢杆菌作为饲料添加剂已被广泛用于水产动物饲料，许玉洁等（2015）研究发现，将枯草芽孢杆菌添加到对虾饲料中，会提高对虾生长发育速率，维持肠道菌群稳定，有利于对虾对饲料的消化、吸收，提高对虾免疫功效。目前，黄鳝的研究主要集中在生长发育、疾病防治等方面，而枯草芽孢杆菌作为黄鳝饲料添加剂的应用比较少。本文中探究不同添加水平枯草芽孢杆菌对黄鳝的肠道菌群和免疫功能的影响，分析和确定黄鳝饲料中枯草芽孢杆菌的最佳添加量，为黄鳝饲料配方中枯草芽孢菌的添加量提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料 黄鳝、枯草芽孢杆菌、饲料原料（高豆、鱼粉、豆粕和玉米蛋白粉等物质）购买于通威饲料有限公司。

1.2 枯草芽孢杆菌的提取 本试验利用硫酸铵沉淀法来获取枯草芽孢杆菌菌体蛋白，放入无菌烧杯内，加入PBS溶解菌体蛋白，过滤后即可加入饲料中。

1.3 饲料配方 试验设计如表1所示，试验饲料成分如表2所示，黄鳝饲料配方中枯草芽孢杆菌的添加水平为0.25%，0.5%，0.75%，1%和1.25%，对照组黄鳝饲料以玉米蛋白粉为蛋白源，没有添加枯草芽孢杆菌。称取所有饲料原料后测定其营养含量，粉碎，并加入水混合，制成2 mm的颗粒料，放入烘干箱干燥处理，放入4℃冰箱备用。

表1 试验设计

表2 饲料中枯草芽孢杆菌的配方原料

1.4 饲养管理要点 试验黄鳝育苗来自教学养殖基地，养殖试验在试验基地网箱中进行，黄鳝按照规格（10.23±0.24）g进行分组，将饲养的黄鳝幼苗随机分为6组，试验组添加基础饲料，对照组添加枯草芽孢杆菌，每组4个重复，每个重复36尾鱼。正式饲养开始前对养殖基地的水塘进行消毒处理，黄鳝苗放入水箱内暂养2周。饲养期间，黄鳝每天投喂适量的饵料，每天2次，根据天气和水温状况及时调整饵料，观察鱼类摄食情况，及时记录养殖情况，定时检测养殖水质，包括溶氧、氨氮、pH和水温情况。饲养试验期间每隔5 d换一次水，换水量为1/3，溶氧程度达到8～10 mg/L，养殖试验为期8周。

1.5 样品采集 饲养试验结束后，对黄鳝初体重和末体重进行测定，依据相应公式计算黄鳝生长发育的相关指标，具体公式如下：

饵料系数（FCR）=动物饲料中总投喂量/动物饲养期间增加的体重；

增重率（WGR，%）=（动物生长后总体重均值－动物生长前的体重均值）/动物生长前的体重均值×100；

特定生长率（SGR，%/d）=100×（ln动物生长后总体重－ln动物生长前的体重）/饲养试验时间。

1.5.1 免疫指标测定 饲养试验结束后，将黄鳝禁食24 h，静脉采血10 mL，放入相关试管内，常温离心后及时放入4℃冰箱保存。

采用相关试剂盒测定黄鳝血清的免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白（IgG）浓度，并检测黄鳝促炎性因子IL-17，IL-6，TNF-a的含量，检测方法参照试剂盒说明书。

1.5.2 肠道菌群指标测定 黄鳝饲养周期结束后，将试验1～5组枯草芽孢杆菌组分别取出3条健康的黄鳝，取黄鳝肠道沉积物，放置于无菌EP管中，依据管越强等（2021）的方法测定黄鳝肠道菌群含量。

1.6 试验数据分析 所有试验数据均采用Excel表格记录，采用SPSS 22.0软件进行方差分析，P＜0.05表示组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝生长相关指标的影响 由表3可知，随着枯草芽孢杆菌添加水平的不断提升，与对照组相比，试验组黄鳝增重率先上升后下降；试验1组和试验5组黄鳝增重率分别为405.3%和439.3%，显著高于对照组（P＜0.05）；在试验3组中，黄鳝增重率达到最高（498.2%），显著高于对照组（P＜0.05），试验2组和试验4组黄鳝增重率显著高于对照组（P＜0.05）。随着枯草芽孢杆菌添加水平不断提升，黄鳝特定生长率先升后降，试验3组黄鳝的特定生长率显著升高，达到最高值（3.23%），显著高于对照组（P＜0.05）；试验2组和4组黄鳝的特定生长率显著高于对照组（P＜0.05），而试验1组和试验5组黄鳝的特定生长率无明显差异（P＞0.05）。随着饲料枯草芽孢杆菌添加水平的升高，黄鳝饲料系数一直下降，试验4组和试验5组黄鳝的饵料系数明显低于对照组（P＜0.05），试验1～3组黄鳝的饵料系数明显低于对照组（P＜0.05），高水平枯草芽孢杆菌饲料组可能会降低黄鳝饵料系数。

表3 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝生长发育的影响

2.2 不同添加水平枯草芽孢杆菌饲料对黄鳝免疫相关指标的影响 由表4可知，随着枯草芽孢杆菌添加水平的升高，试验1～5组黄鳝血清IgM的浓度先升高后降低，试验1组（0.25%）和试验5组（1.25%）黄鳝血清中的IgM浓度明显高于对照组（P＜0.05），试验3组黄鳝血清IgM浓度显著上升，并达到最高水平，为1.67ng/L，显著高于对照组（P＜0.05），试验1组和试验3组黄鳝血清IgM浓度明显高于对照组（P＜0.05）。试验1～5组黄鳝血清IgA浓度随饲料枯草芽孢杆菌的添加水平的升高先升高后降低。在试验3组中，黄鳝血清中IgA浓度达到最高水平，为1.23ng/L，显著高于对照组（P＜0.05），试验5组中黄鳝血清IgA浓度与对照组无显著差异，在试验3组中黄鳝血清IgG的浓度最高，为3.54ng/L，明显高于对照组（P＜0.05），试验4组次之，显著高于对照组（P＜0.05），试验1组和5组黄鳝血清的IgG浓度显著高于对照组（P＜0.05）。

表4 不同水平枯草芽孢杆菌饲料对黄鳝血清免疫球蛋白浓度的影响

不同添加水平枯草芽孢杆菌饲料与黄鳝炎性因子相关指标有密切联系，由图1～3可知，试验3～5组中，黄鳝血清中IL-17浓度明显下降，显著低于对照组（P＜0.05），试验1～2组中，黄鳝血清中IL-17浓度与对照组无明显差异（P＞0.05）；试验2～5组黄鳝血清TNF-α浓度明显下降，显著低于对照组（P＜0.05），试验1组黄鳝血清TNF-α浓度与对照组无明显差异（P＞0.05）；试验2～5组中，黄鳝血清IL-6浓度不断下降，显著低于对照组（P＜0.05），试验1组黄鳝IL-6含量与对照组无较大差异（P＞0.05）。

图1 不同试验组中黄鳝的IL-17含量

图2 不同试验组中黄鳝的TNF-a含量

图3 不同试验组中黄鳝的IL-6浓度

2.3 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝肠道菌群相关指标的影响 由表5可知，不同添加水平的枯草芽孢杆菌对黄鳝链球菌属无显著影响（P＞0.05），随着枯草芽孢杆菌添加水平不断升高，黄鳝肠道中气单胞菌属和致病杆菌的含量先上升后下降，试验3组气单胞菌属和致病杆菌属的含量达到最高水平，其值分别是8.05 CFU/g和9.73CFU/g，显著高于其他对照组（P＜0.05），其余各组黄鳝肠道中气单胞菌属和致病杆菌属含量显著高于对照组（P＜0.05）；随着枯草芽孢杆菌添加水平的升高，黄鳝肠道中假单胞菌属含量不断上升，均显著高于对照组（P＜0.05）；在试验3组中，黄鳝肠道中芽孢杆菌属的含量明显高于对照组（P＜0.05），达到最高水平（10.04 CFU/g），显著高于对照组（P＜0.05），其他试验组中黄鳝肠道内芽孢杆菌属含量明显高于对照组（P＜0.05）。

表5 不同添加水平的枯草芽孢杆菌饲料对黄鳝肠道菌群的影响 lg CFU/g

3 讨论

随着黄鳝集约化养殖规模不断扩大，提高黄鳝养殖密度可能会增加黄鳝苗种患病概率，而抗生素对动物机体会产生耐药性，且药物残留量大，因此，枯草芽孢杆菌作为绿色益生菌可有效代替抗生素，成为一种环保、安全的绿色饲料添加剂。

3.1 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝生长发育的影响 枯草芽孢杆菌是一种益生菌，被广泛应用于水产动物饲料中。枯草芽孢杆菌具有耐酸、耐高温、稳定性强等特点，能满足动物体的营养需求，促进肠道分泌多种消化酶，扩大肠道绒毛结构，提高动物对营养的消化吸收效率，改善肠道菌群的健康模式，有助于动物生长。本研究结果发现，枯草芽孢杆菌添加水平为0.75%时将会显著提高黄鳝增重率。本研究与孙盛明（2016）等在团头鲂（Megalobrama amblycephala）上的研究结果类似。许玉洁等（2015）研究发现，枯草芽胞杆菌是对虾的饲料添加剂，当添加水平为0.5%时，对虾特定生长率和增重率明显上升，说明适量的枯草芽孢杆菌有助于对虾的生长，但高水平的枯草芽孢杆菌将会降低对虾增重率，使对虾的生长发育受到限制。管越强等（2010）研究发现，当添加剂枯草芽孢杆菌的添加量为1.0和0.5 g/kg可有效提高中华鳖的生长速率，当枯草芽孢杆菌添加量为4.1 g/kg时，中华鳖的特定增长率明显低于对照组，增重率下降，结果表明，添加高水平枯草芽孢杆菌会抑制中华鳖的生长发育。本研究发现，高添加水平（1.25%）枯草芽孢杆菌组黄鳝生长发育速率显著低于低添加水平（0.5%）组，产生这一结果的主要原因是黄鳝肠道一旦含有大量枯草芽孢杆菌，过多的枯草芽孢杆菌会打破肠道原有的菌群平衡，抑制肠道消化酶活性，降低肠道对营养物质的吸收效率，从而使鱼体缺乏足够的营养，导致生长发育受到限制。

本研究发现，饲料枯草芽孢杆菌的添加水平为0.75%，对黄鳝生长发育有明显影响；随着黄鳝饲料枯草芽孢杆菌添加水平的不断上升，黄鳝饵料系数不断降低，表明饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌可显著提高黄鳝肠道对饲料的消化吸收，其可能的原因是适量枯草芽孢杆菌被黄鳝肠道消化吸收后将会增加有益菌数量，维持肠道有益菌群平衡，同时刺激肠道分泌各类消化酶，维持消化酶活性，加速饲料分解过程，增强肠道绒毛面积，促进机体对饲料原料的吸收，使鱼体的体重增加。

3.2 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝免疫功能的影响 血清中免疫球蛋白含量可反映机体免疫功能的高低。IgA免疫球蛋白可有效抑制肠道黏膜处的细菌。IgG能激活机体内的补体，抵御外来毒素作用。IgM在机体中可发挥重要作用，清除体内病原体，防止外来病原的侵袭（许玉洁等，2015；沈斌乾等，2013；粟雄高等，2012）。本研究发现，枯草芽孢杆菌添加水平0.75%时，黄鳝血清中IgG和IgM的浓度高于对照组，表明黄鳝饲料中适宜水平枯草芽孢杆菌可改善黄鳝免疫功效，增强机体免疫机能。IL-6、IL-17和TNF-a是促炎性因子，其浓度反应动物免疫功效。本研究发现，随着饲料枯草芽孢杆菌添加水平不断增加，黄鳝血清中IL-6，IL-17和TNF-a的浓度不断下降，表明添加适量水平枯草芽孢杆菌会改善黄鳝的免疫功能。李浩等（2020）研究发现，饲料中添加适宜水平益生菌可能会提高猪的免疫力。这些研究结果表明，动物饲料中添加益生菌有助于提高动物机体免疫功效，其主要因素是枯草芽孢杆菌可能提高益生菌的生产能力，有助于有益菌的生长，保持肠道内部环境稳定，维持肠道内部健康，促进相关免疫菌群结构稳定，提高肠道免疫相关功效，从而提高动物机体免疫功效。

3.3 不同水平枯草芽孢杆菌对黄鳝肠道菌群的影响 试验结果发现，适宜添加水平的枯草芽孢杆菌组黄鳝肠道内芽孢杆菌属的含量和假单胞菌属的含量明显升高，均高于对照组，结果表明，适宜添加水平枯草芽孢杆菌将会有效改善黄鳝肠道健康，维持黄鳝肠道结构和菌群平衡。张献月等（2013）研究表明，肉鸡饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌将会显著影响肉鸡肠道形态，提高肉鸡对营养物质的消化吸收。雷玉杰等（2020）研究发现，饲料中添加一定量的酵母物可有效改善斑马鱼的肠道健康，促进机体生长。因此，饲料中添加适量的枯草芽孢杆菌有助于提高黄鳝健康发育，改善黄鳝免疫性能。

4 结论

在饲料中添加枯草芽孢杆菌会对黄鳝增重率和特定生长率产生促进作用，促进黄鳝幼苗的生长发育，有利于改善肠道健康状况，维持肠道内环境稳定，从而有助于恢复黄鳝健康。在本试验中，饲料添加0.75%的枯草芽孢杆菌效果最好，有利于黄鳝生长发育，增强黄鳝免疫功效。