牛呼吸道合胞体病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

2022-02-21杨昱萍刘建青

中国饲料 2022年2期

杨昱萍，李珍，刘建青

（包头师范学院生物科学与技术学院，内蒙古包头 014030）

牛呼吸道合胞体病毒（Bovine respiratory syncytial virus，BRSV）是单分子负链RNA病毒目（Mononegavirales）的成员，主要侵害牛的呼吸道，临床可见咳嗽、呼吸急迫、流泪、流鼻液及流涎等症状（Mathieu等，2007）。BRSV还可导致牛的白血球减少症，乳牛泌乳量显著减少，甚至停止，怀孕母牛发生流产等，给养牛业造成很大的经济损失（冯军科等，2010）。因此，快速检测牛场BRSV具有重要意义。

随着科学技术的发展，检测BRSV的成熟方法有好几种，主要有免疫学检测、病毒的细胞培养法、电子显微镜观察病毒粒子及RT-PCR检测法（Ulrike等，2002）。由于BRSV接种到细胞上大约5 d才会出现病变，多数情况下病变并不明显，且不易观察，严重影响该方法的检出率。此外，尽管电子显微镜观察病毒粒子用时较短，但敏感性不高。相反，RT-PCR是一种高效、敏感、稳定的检测方法，是实验室检测BRSV最常用的方法（Juan等，2001）。提取病毒核酸，利用Primer5.0设计特异性检测引物是该方法的关键。本研究旨在建立一种RT-PCR方法，能快速、有效地检测BRSV，为防治BRSV提供相应帮助。

1 材料与方法

1.1 毒株及对照细胞牛呼吸道合胞体病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒3型、口蹄疫病毒、MDBK细胞均由本实验室保存。

将BRSV接种到长成单层MDBK细胞上，当细胞发生明显病变时收获病毒液，-70℃保存备用（Philip等，2006）。

1.2 常规试剂与RT-PCR试剂购自北京化工有限公司和大连宝生物公司。

1.3 引物的设计与合成根据已发表的BRSV各毒株的全序列，选择保守性较强的N基因，利用Primer 5.0设计合成了一对特异性引物，由Invitrogen（北京）公司合成。引物序列如下：

上游引物：

下游引物：

1.4 病毒RNA的提取按照Trizol Reagent 试剂的说明提取BRSV总RNA（Prozzi等，1997）。

主要步骤如下：

（1）吸取样品250 μL，加入Trizol Reagent裂解液750 μL，颠倒混匀，室温放置5 min。

（2）加入200 μL氯仿，混匀，室温放置5 min。

（3）4℃，12000 r/min离心10 min。

（4）取600 μL水层液体至新的、DEPC处理过的1.5mL离心管中，然后加入600 ul异丙醇，室温静置30 min。

（5）4℃，12000 r/min离心10 min。

（6）倒掉上清，用1000 μL 75% DEPC冰乙醇洗涤。

（7）12000 r/min，4℃，离心10 min。

（8）倒掉乙醇，置于通风橱中干燥20 min。

（9）加入20～30 μL DEPC水溶解。

（10）-80℃保存。

1.5 反转录合成cDNA 吸取4 μL RNA提取液于离心管中，加入2 μL Random Primers、5 μL DEPC水、4 μL 5×Buffer、3 μL 10mmol/L dNTPs、1 μL Rnasin（40U/μL）、1 μL AMV，总体积20μL。42℃水浴1 h（Valarcher等，1999）。

1.6 PCR扩增反应在反应体系中依次加入2μL cDNA、16 μL超纯水、2.5 μL 10×Buffer、上游下游引物各1 μL、2 μL dNTPs、0.5 μL E Taq，总体积是25 μL。PCR反应条件是95℃预变性5 min、94℃变性30 s，47℃ 30 s，72℃延伸30 s，30个循环，72℃充分延伸10 min。

1.7 PCR产物的检测 PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.8 RT-PCR特异性与敏感性检测取BRSV细胞培养物、牛病毒性腹泻病毒、牛副流感病毒、牛传染性鼻气管炎病毒3型病毒、口蹄疫病毒、MDBK正常细胞培养物，分别提取RNA进行RTPCR，进行电泳。将BRSV的细胞培养物提取RNA并且定量，进行10倍梯度稀释，分别进行RT-PCR，电泳，观察试验结果。

1.9 临床应用采集38份临床症状类似BRSV引起流鼻液的鼻拭子样品，应用上述方法进行RT-PCR检测。