游泳训练对脑出血大鼠认知功能及NMDAR表达的影响

徐泽红 孙林林 郭付有

脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)作为一种常见的脑血管疾病，其病死率和致残率极高，50%的幸存者有认知功能障碍，对此目前尚缺乏有效的治疗方法[1-3]。游泳可改善脑缺血后的认知功能障碍[4]，但其对ICH导致的认知功能障碍是否有效，目前尚未明确。研究[5-6]发现，ICH后神经细胞坏死，突触可塑性破坏，炎症因子大量释放，谷氨酸大量释放，与 N-甲基-d-天冬氨酸受体(N-methyl-d-aspartate receptor, NMDAR)过度激活有关。NMDAR包括NR1和NR2B亚基，是记忆形成的基础，与神经突触的功能和行为认知有密切关系[7]。文献[8]报道,可通过降低NR1和NR2B亚基的表达改善卒中大鼠的神经功能。目前游泳训练改善认知功能的机制尚不明确，本研究建立ICH大鼠模型，观察游泳训练是否可改善ICH大鼠的认知障碍并以NMDAR为靶点进一步探讨其调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 成年雄性Sprague-Dawley大鼠30只，由郑州市第七人民医院动物实验中心提供，体质量(300±50)g，8周龄。每笼5只大鼠，饲养温度22～24℃，光/暗循环保持12/12 h交替，自由进食、水，喂养1周。实验前，所有大鼠进行适应性游泳训练，共3 d(第1天训练10 min，第2天20 min，第3天30 min)。第4天，将大鼠根据随机数字表法分为3组，即假手术组、模型组、游泳组，每组各10只。本实验研究方案已得到郑州市第七人民医院伦理委员会批准。

1.2 试剂及仪器 试剂：蛋白质浓度测定试剂盒(Bioswamp，湖北)，一抗NMDAR (CST，美国)，荧光二抗(Santa Cruz，美国)，一抗NR1(Abcam，美国)，NR2B(Abcam，美国)。仪器：正置荧光显微镜(Olympus，日本)，Morris水迷宫(淮北正华，安徽)。

1.3 动物模型制作方法 模型组和游泳组参考Zhang等[9]文献所述方法制作动物模型，大鼠术前禁食水6 h后， 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剂量350 mg/kg。将其以俯卧位固定于脑立体定位仪上。颅顶做切口，暴露冠状缝，定位右侧尾状核区 (冠状缝前0.2 mm，中线偏右侧3 mm)，颅骨钻孔达硬脑膜。使用5 μL的微量注射器，沿孔垂直刺入脑内，深度达6 mm，将2 μL I型胶原酶及1 μL肝素钠溶液以0.3 μL/min的速度缓慢注入尾状核内，总注射时间为10 min。注射后，停留10 min，然后缓慢将针拔出。拔针后，用医用骨蜡密封钻孔，缝合切口。假手术组同模型组做切口，颅骨钻孔达硬脑膜，插入微量注射器针头至右侧尾状核，停留10 min，缓慢拔针，骨蜡封闭，缝合切口。

术后2 h待大鼠清醒后采用改良的神经功能缺损评分法(modifiedneurological severity score, mNSS)[10]，评分7～12分的大鼠视为模型建立成功。

1.4 游泳训练 模型制作成功后1周，游泳组大鼠进行游泳训练。将大鼠放入游泳池 (直径：0.6 m，高度：1 m)，水温保持在29～31℃，水面距桶边缘0.4 m，每天游泳60 min，连续训练5 d。另外两组不进行游泳训练。

1.5 神经功能评分 造模成功后及经1 d、3 d、5 d游泳训练后进行神经功能缺损评分。采用mNSS量表[10]对各组大鼠进行神经功能评定。包括提尾反射、反常运动、平衡木实验、行走测试、反射缺失和感觉测试等。评判标准：轻型受损1～6分，中型受损7～12分，重型受损13～18分。

1.6 水迷宫检测 造模成功后2周，用水迷宫(morris water maze test, MWM)法评价3组大鼠术后认知功能。实验前，所有大鼠都在MWM里自由游泳15 min。在定位导航任务中，将大鼠面向池壁随机放置在同一象限上，本实验持续4 d，每天记录大鼠在120 s 内找到平台的时间，即为逃避潜伏期。取下平台，把大鼠放进水池，每天记录120 s 内目标象限的时间百分比。

1.7 免疫荧光 完成MWM检测后，处死大鼠，取脑组织，常规石蜡包埋，取厚度5 μm切片，在0.01 M PBS 中清洗切片3次，每次5 min，共15 min，滴加蛋白酶K进行消化处理， 37℃条件下孵育5 min。抗原封闭处理采用山羊血清，先滴加一抗 N-甲基-d-天冬氨酸受体(NMDAR, 1∶100，美国CST)，在4℃条件下孵育过夜；再滴加二抗(FITC，1∶50，Santa Cruz)，在室温下孵育90 min。用PBS清洗玻片2次，每次5 min。4’，6’-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI, 1∶200，Santa Cruz)对细胞核进行染色，滴加甘油封片。荧光显微镜(Olympus, TXM-500C)下观察，400倍镜下随机选取3个视野进行拍照，观察免疫阳性强弱。

1.8 蛋白印迹 完成MWM检测后，深度麻醉大鼠，迅速断头，冰上取脑，快速分离对侧海马CA3区，置于预冷EP管中，随后保存在-80℃的冰箱中，手术需在2 min内完成。将组织切成小块，加入裂解液，其中混有蛋白酶和磷酸酶抑制剂。放入4℃离心机1 000 r/min 离心15 min，取其上清液，进行蛋白定量，保存在-80℃冰箱。等效样品(10 μg)高压锅煮沸变性，采用SDS-聚丙烯酞胺凝胶电泳，90 V湿式转膜50 min。采用5%脱脂奶粉封闭抗原2 h，一抗NR1、NR2B 在4℃条件孵育过夜，PBS洗膜5 min，重复洗3次。1∶1 000的辣根过氧化物酶标记的二抗，在室温下孵育1 h。用PBS洗涤3次，每次5 min。按说明书1∶1均匀混合ECL化学发光试剂A和B，全自动化学发光显影。分析条带的灰度值利用Image J软件进行。

2 结果

2.1 3组大鼠不同游泳时间mNSS评分比较 重复测量方差分析结果显示，组别和时间交互作用差异无统计学意义(P>0.05)；组间差异有统计学意义，即与模型组相比，游泳组的mNSS评分更低，差异有统计学意义(P<0.05)；mNSS评分随时间降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠mNSS评分的比较分)

2.2 3组大鼠不同时间认知功能的比较 3组大鼠逃避潜伏期随着时间变化而缩短，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比较，模型组各时间点逃避潜伏期均延长，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组相比较，游泳组在第2、3、4天逃避潜伏期均缩短，差异具有统计学意义(P<0.05)，组别和时间交互作用下无统计学意义(P>0.05)。 3组大鼠目标象限时间占比随着时间变化而增加，差异有统计学意义(P<0.05)；与假手术组相比较，模型组各时间点目标象限时间占比均减小，差异有统计学意义(P<0.05)，与模型组相比较，游泳组在第2、3、4天目标象限时间占比均增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，组别和时间交互作用无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组大鼠逃避潜伏期和目标象限时间占比的比较

2.3 3组大鼠NMDAR免疫荧光结果比较 取各组大鼠脑组织，冠状位切片，进行NMDAR免疫荧光染色，置于免疫荧光显微镜下观察CA3区。假手术组的样本可见少量NMDAR免疫阳性的神经细胞被绿色荧光标记，阳性细胞占比为(22.5±0.03)%；模型组NMDAR免疫阳性神经细胞数为(60.6±0.05)%，游泳组 NMDAR 免疫阳性神经细胞数为(43.5±0.04)%，差异有统计学意义(F=1.309，P<0.001)。见图1。

假手术组 模型组 游泳组

2.4 NR1和NR2B Western blot检测结果比较 采用Western blot检测各组大鼠海马CA3区NR1和NR2B蛋白的表达水平。与假手术组相比，模型组大鼠海马CA3区NR1和NR2B表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05 )；与模型组相比，游泳组海马CA3区NR1和NR2B的表达减少，差异有统计学意义(P<0.05 )。见图2、表3。

图2 各组大鼠海马CA3区NR1和NR2B Western blot结果

表3 各组大鼠海马CA3区NR1和NR2B蛋白表达量的比较

3 讨论

研究[11]报道，游泳可改善出血性卒中大鼠的认知功能，其机制可能是通过促进大鼠海马区神经营养因子的释放，减少突触损伤，促进突触生长改善认知障碍。本实验结果发现，与模型组相比较，游泳组的逃避潜伏期明显缩短，目标象限时间明显延长，表明游泳可能改善了脑出血大鼠的认知功能。

NMDAR是一谷氨酸受体[12]，在静止状态下，NMDAR的离子通道被Mg2+阻塞，当突触前膜释放谷氨酸时，激活的α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体，导致突触后膜的部分去极化，从而NMDAR通道中的Mg2+被清除，NMDAR被激活，大量的Ca2+通过NMDAR通道流入导致细胞死亡[13]。生理情况下，谷氨酰胺合成酶可以将谷氨酸转化为谷氨酰胺[14]。缺血和缺氧情况下，谷氨酸合成酶的表达量明显下降，导致谷氨酸释放引起的兴奋性毒性持续存在[15]。谷氨酸的兴奋性毒性可直接导致ICH大鼠的认知功能障碍[4]。本研究中，应用免疫荧光染色发现游泳可明显减少大鼠海马CA3区NMDAR的表达，进而减少谷氨酸的神经毒性。

本研究发现，游泳可明显下调大鼠海马中NR1和NR2B的表达，可能是其改善ICH大鼠认知功能(MWM实验逃避潜伏期明显缩短，目标象限时间明显延长)的分子机制。NR1和NR2B 是NMDAR的两个亚单位，均参与细胞死亡，该受体激活后导致兴奋性毒性和神经细胞凋亡[16]。已有研究[17]发现ICH后继发性炎症与NR1亚单位的表达和磷酸化有关。NR1自身抗体可以减少缺血性卒中患者的脑梗死面积[18]。也有研究[19]证实，使用NR1疫苗或药物降低NR1的表达也能保护脑卒中后的神经元，使神经元和树突结构更加完整，降低兴奋性毒性。有研究[20]报道，使用NR2B抑制剂后，可减轻谷氨酸诱导的兴奋性毒性，保护脑梗塞后的神经元，减少梗塞面积，促进神经功能恢复。此外，文旬等[18]研究发现，NR2B拮抗剂能有效抑制脑梗塞大鼠的神经损伤，改善脑梗塞大鼠的空间记忆，提示抑制NR2B的表达有利于认知恢复。Zhen等[5]在脑出血动物模型研究中也发现，抑制NR2B表达有利于认知功能的恢复。因此，笔者推测NR2B受体的激活可能是ICH大鼠认知功能受损的重要机制，游泳可下调NR2B的表达，促进神经功能的恢复。

综上所述，ICH后大鼠海马区NMDAR激活，引起认知功能障碍。游泳可能通过下调NMDAR的NR1和NR2B亚基的表达，从而谷氨酸的兴奋性毒性被抑制，改善ICH后的认知功能。