大叶紫珠中二氯甲烷萃取物化学成分研究

石丽莉，郑 苏，单舒筠

（江苏省徐州医药高等职业学校，江苏 徐州 221116）

0 引言

马鞭草科紫珠属植物大叶紫珠（Callicarpa Macrophylla Vahl），又名紫珠草、止血草、大叶斑鸠米等，苗药称其为“豆嘎先”，是一种野生的常用中草药；其味辛、苦，性平，归肝、肺、胃经，具有散瘀止血，消肿止痛之功效，主治衄血、咯血、吐血、便血、外伤出血及跌扑肿痛[1]。大叶紫珠原植物为灌木，在我国广东、广西、海南、贵州、云南等省区均有出产；其叶对生，叶片呈长椭圆形单叶，叶面及叶背均具绒毛，叶背绒毛密生，腺点隐于毛中；其嫩枝呈近四方形，密生灰白色分枝绒毛。民间习用大叶紫珠根、枝、叶入药，鲜用或晒干；2010年版《中国药典》将大叶紫珠作为新增中药品种收录，记载要求夏秋两季采摘其叶或带叶嫩枝，晒干入药。现代天然药物化学研究表明，大叶紫珠中含黄酮类、萜类、苯丙素类、甾体类等多种化学成分[2-5]，对大叶紫珠的药效物质基础研究大多以止血作用为主，为了更好地开发利用大叶紫珠的药用价值，发现其中的更多活性物质，本实验着重对大叶紫珠乙醇超声提取物二氯甲烷萃取层进行了系统的研究，从中分离鉴定出7个单体化合物，分别为urs-12-en-3β-ol 、Oleanic acid 、β-sitosterol 、luteolin 、luteolin -4＇-O-（6＇＇-E-caffeoyl）-β-D-glucopyranoside 、luteolin -7-O-（6＇＇-E- feruloyl）-β-D- glucopyranoside 、4-methoxybenzoic acid，为大叶紫珠的药用价值开发利用提供药效物质基础的理论依据，为药理药剂应用研究提供参考。

1 仪器与材料

Bruker-DRX-600型核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；Agilent 1260高效液相色谱系统，四元泵，DAD检测器，Agilent Chemstation色谱工作站（美国Agilent公司）；Buchi R-114旋转蒸发仪（瑞士步琦有限公司）；SK250HP超声波提取器（上海科导超声仪器有限公司）；Combi Flash Rf 200中低压快速分离色谱仪（美国Teledyne科技有限公司）；制备型HPLC（Shimadzu，Tokyo，日本）：泵Shimadzu LC-20AR、检测器Shimadzu SPD-20A、色谱柱Shimpack RP-C18 column （10 μ m， 200 mm× 20 mm）；中压色谱分离凝胶MCI（德国Merck公司）；薄层层析硅胶板HSGF254，GF254（青岛海洋化工有限公司）；凝胶柱层析Sephadex LH-20（美国GE公司）；柱层析填料硅胶（100～200目，青岛海洋化工有限公司）；HPLC分析使用色谱纯试剂，硅胶柱色谱洗脱等使用分析纯试剂。

2 提取与分离

称取大叶紫珠干燥叶2．5 kg，以适量95%的乙醇超声提取2次，3 h/次，合并两次提取液，旋转蒸发浓缩至流浸膏，加水混悬。将混悬液依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分别萃取2～3次，将各溶剂层萃取液合并，回收溶剂，浓缩至浸膏状，真空干燥后记录各萃取层所得膏体的收率如下：石油醚层为2．9%、二氯甲烷层为50．5%、乙酸乙酯层为3．4%、正丁醇层为22．1%。取二氯甲烷萃取部位，采用硅胶柱色谱进行分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯（100∶1→50∶1→30∶1→15∶1→10∶1→5∶1→2∶1→1∶1→1∶5）和乙酸乙酯梯度洗脱，TLC检测，合并相同 Rf值的流分，得 23 个组分（Fr．1～Fr．23）。Fr．3 有大量物质在甲醇中难溶，过滤得到化合物1（119．6 mg）。Fr．11经中低压快速分离色谱硅胶柱色谱（二氯甲烷∶甲醇，80∶1→1∶1）梯度洗脱后，得到5个组分（Fr．11-1～Fr．11-5）；Fr．11-2（73．1 mg） 经凝胶柱层析，二氯甲烷-甲醇（1∶1）洗脱得化合物Oleanicacid（49．3 mg）。Fr．11-3（178．4 mg）经凝胶柱层析，甲醇洗脱后得少量白色粉末，二氯甲烷反复洗涤重结晶纯化得化合物β-sitosterol （41．3 mg）。Fr．17经中低压快速分离色谱C18柱色谱（甲醇—水，20%→100%）梯度洗脱后，得到6个组分（Fr．17-1～Fr．17-6）；Fr．17-2 在甲醇中有大量黄色沉淀析出，过滤纯化得化合物 luteolin （101．7 mg）。Fr．17-4（254．4 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱层析，甲醇洗脱后得化合物 luteolin -4＇-O-（6＇＇-E- caffeoyl）-β-D-glucopyranoside （13．2 mg）和化合物 luteolin -7-O-（6＇-E-feruloyl）-β-D- glucopyranoside （28．5 mg）。Fr．19经中低压快速分离色谱C18柱色谱（甲醇—水，40%→100%）梯度洗脱后，得到 5 个组分（Fr．19-1 ～ Fr．19-5），Fr．19-4 （192．6 mg） 经凝胶柱层析，甲醇洗脱得5个组分（Fr．19-4-1～Fr．19-4-5）；Fr．19-4-4（28．4 mg）经制备液相（波长254 nm；乙腈∶0．5%甲酸，62∶38；流速3 mL/min）得化合物 4-methoxybenzoic acid（21．2 mg）。

3 结构鉴定

3.1 化合物1：urs-12-en-3β-ol

化合物1为白色丝状晶体（二氯甲烷），醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性。1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）谱（图1）给出1个烯氢多重峰信号5．12（1 H，m，H-12），并且为环内双键；1个连氧叔碳原子上的氢多重峰信号2．46（1 H，m，H-3）；6个甲基单峰氢信号，分别为0．77、0．80、1．07、1．25、4．28、5．08 和 2 个甲基双峰信号0．93（3 H，d，J=6．0 Hz）、0．87（3 H，d，J=6．0 Hz）。13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）谱（图2）显示有30个碳信号。其中，1个连氧碳信号77．3（C-3）；2 个烯碳信号145．2（C-13）、124．5（C-12），提示该化合物为乌苏-12-烯型五环三萜类。其余27个碳信号如下：58．9（C-18），55．2（C-5），47．6（C-9），42．0（C-14），41．4（C-22），40．0（C-8），38．8（C-19，20），36．8（C-1），36．4（C-4），34．9（C-10），33．8（C-17），32．9（C-7），31．2（C-21），28．9（C-15），28．6（C-23），28．0（C-28），27．4（C-2），26．6（C-16），23．5（C-11），23．4（C-30），21．7（C-27），18．4（C-6），17．8（C-29），17．0（C-26），16．5（C-25），15．9（C-24）。13C-NMR 谱数据与文献[6]至文献[9]、文献[18]、文献[20]报道的数据基本一致，故鉴定该化合物为urs-12-en-3β-o（l乌苏-12-烯-3β-醇）。

图1 化合物urs-12-en-3β-ol的1H-NMR谱图

图2 化合物urs-12-en-3β-ol的13C-NMR谱图

3.2 化合物2：Oleanic acid

该化合物为白色粉末状固体，1H-NMR（600 MHz，CH3OH+D2O）谱（图3）给出 1个羧基上的氢信号5．24（C3-OH）；1个连氧原子上的氢信号分别为5．64（C12-H）；7个甲基单峰氢信号分别为0．94、0．97、1．01、1．07、1．09、1．53、1．55。13C-NMR（ 151 MHz， CH3OH+D2O）谱（图4）显示有30个碳信号。其中，1个连甲氧基碳信号23．9（C-3）；1个羧基碳信号180．0（C-28）；其余28个碳信号15．8（C-25），16．3（C-24），17．7（C-26），19．5（C-6），23．9（C-11，16），24．0（C-27），24．5（C-2），26．3（C-15），27．8（C-23），28．7（C-20），31．6（C-7，22，29），33．5（C-21），33．8（C-10），34．9（C-1），38．1（C-4），39．8（C-8），42．7（C-18），42．8（C-14），47．6（C-19），46．6（C-17），48．0（C-9），56．7（C-5），79．7（C-3），123．6（C-12），145．2（C-13）。以上数据与文献[8]、文献[10]至[12]、文献[20]报道基本一致。故鉴定该化合物为Oleanic acid（齐墩果酸）。

图3 Oleanic acid的1H-NMR谱图

图4 化合物Oleanic acid的13C-NMR谱图

3.3 化合物3：β-sitosterol

该化合物为白色针状结晶（ 二氯甲烷），醋酸酐-浓硫酸反应呈阳性。与β-谷甾醇对照品比较，TLC薄层色谱经多种展开剂展开，香草醛-浓硫酸反应显紫色，Rf值及显色均与对照品显示一致且混合熔点未下降。该化合物1H-NMR（600 MHz，chloroform）谱图显示有 2 个甲基单峰信号0．72（ 3 H，s），1．09（3 H，s）；4个甲基多重峰信号0．88（ 3 H，m），0．92（3 H，m），1．02（3 H，m），1．01（3 H，m）； 1 个烯氢质子多重峰信号5．44（ 1 H，m），1 个连氧次甲基质子多重峰信号3．87（ 1 H，m）；该化合物13C-NMR（151 MHz， chloroform）谱图显示 29 个碳信号，根据分子式计算其不饱和度为 5。其中，13C-NMR（151 MHz， chloroform） 给 出120．75（C-5） 与141．5（C-6）双键信号，70．79（C-3）连氧碳信号。对比文献[7]中的数据，与上述数据基本一致，故鉴定该化合物为β-sitosterol（β-谷甾醇）。

3.4 化合物4：luteolin

该化合物为黄色粉末状固体，TLC薄层色谱有紫外吸收。1H-NMR（600 MHz， DMSO）谱低场区显示有1个活泼的氢单峰信号12．98（1 H，s，OH-5）；1个氢质子宽双峰信号7．42（1 H，dd， J = 8．2， 2．2 Hz， H-6＇）；2 个氢质子双重峰信号7．40（1 H，d，J = 2．2 Hz，H-2＇），6．89（1 H，d，J=8．2 Hz，H-5＇）；1个氢质子单峰信号6．67（1 H，s，H-3）。分析数据表明该化合物结构属B环上3＇， 4＇位取代的类型；此外，2个氢质子双重峰信号6．18（1 H，d，J = 2．0 Hz，H-6） 和 6．43（1 H， d，J =2．0 Hz，H-8） 分别表示为A环上6位和8位质子的间位偶合；该化合物13C-NMR（151 MHz，DMSO-d6）谱给出碳信号163．9（C-2），102．9（C-3），181．6（C-4），157．3（C-5），98．8（C-6），164．1（C-7），93．8（C-8），161．5（C-9），103．7（C-10），121．6（C-1＇），113．4（C-2＇），145．7（C-3＇），149．7（C-4＇），116．0（C-5＇），119．0（ C-6＇）。对比文献[5]和文献[13]报道的数据与上述数据基本一致，故鉴定该化合物为luteolin（木犀草素）。

3.5 化合物 5：luteolin -4＇-O-（6＇-E- caffeoyl）-β-D-glucopyranoside

该化合物为黄色粉末状固体，13C-NMR （151 MHz，DMSO-d6） 与1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） 谱数据见表1，与文献[13]至[16]报道的luteolin-4＇-O-（6＇-E-Caftaril）-β-D-glucopyranoside的数据基本一致，鉴定该化合物为luteolin-4＇-O-（6＇-E-Caftaril）-β-D-glucopyranoside（咖啡酰木犀草苷）。

表1 化合物 5、6 13C-NMR （151 MHz， DMSO-d6）与 1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6）数据

3.6 化合物 6：luteolin -7-O-（6＇-E- feruloyl）-β-D- glucopyranoside

该化合物为黄色粉末状固体，13C-NMR （151 MHz，DMSO-d6） 与1H-NMR（600 MHz， DMSO-d6） 谱数据见表1，与文献[13]至[16]报道的luteolin-7-O-（6＇-E- Feruloyl）-β-D-glucopyranoside的数据基本一致，鉴定该化合物为luteolin-7-O-（6＇＇-E- Feruloyl）-β-D-glucopyranoside（阿魏酰木犀草苷）。

3.7 化合物7：4-methoxybenzoic acid

该化合物为白色粉末状固体，1H-NMR（600 MHz，CD3OD）谱数据有1个羧酸（ -COOH） 中的氢单峰信号11．74（1 H，s）；2个双重峰信号7．98（ 2 H，d，J=8．8 Hz， H-2，6）、6．97（ 2 H，d，J=8．8 Hz， H-3，5）， 其中7．98（H-2，6）应与羧基直接连接碳原子邻位的氢，6．97（H-3，5）应与甲氧基直接连接碳原子邻位的氢；3．83（3H，s， OCH3）应为甲氧基上的甲基氢单峰信号。该化合物13C-NMR（ 151 MHz， CD3OD）谱给出6个碳信号，分别为170．4，164．9，132．9，124．6，115．1，55．3。对比文献[17]至[20]数据，该化合物鉴定为4-methoxybenzoic acid（对甲氧基苯甲酸）。

4 结论

大叶紫珠（Callicarpa Macrophylla Vahl）二氯甲烷萃取物的化学成分研究中得到两种萜类化合物（1，2），一种甾体化合物（3），三种黄酮类化合物（4，5，6），一种苯甲酸类化合物（7），化合物结构式如图5所示。

图5 化合物结构式

中药材大叶紫珠中含黄酮类、萜类、苯丙素类、甾体类等多种类型的化合物[2-5]，其中，文献检索频次及含量较多的为黄酮类和萜类及其苷类。黄酮类成分的抗炎作用、萜类成分的细胞毒活性在抗癌方面的治疗效果，均具有很高的药用价值。为了更深入阐明大叶紫珠的药效物质基础，本实验运用传统与现代化相结合的分离纯化手段，以中低压快速分离色谱为主，多种色谱方法相结合，建立了一套快速、高效地对大叶紫珠乙醇超声提取物进行系统研究的工艺方法。下一步将针对大叶紫珠乙醇超声提取物乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物做系统研究，以期发现更多其中含有的药效物质成分。