微生物发酵对杂粮代餐粉品质特性及抗氧化活性的影响

陈 悦，陈 岚，高 路

(沈阳师范大学粮食学院，沈阳 110034)

代餐粉是一种单一或综合性冲调粉剂产品，主要以谷类、豆类、薯类为原料，方便即时、易于携带[1]。谷物富含蛋白质且氨基酸分布均衡，含有大量的膳食纤维、铁、锌、维生素等营养成分[2]。杂粮富含的膳食纤维可增加人体饱腹感，延缓食物消化速度；杂粮中的植物固醇在一定程度上也可降低胆固醇的含量，对调节血糖血压、降低人体慢性病的发病率起着重要作用[3]。但杂粮中的膳食纤维使产品适口性变差、冲调性下降，因此杂粮在投入工业生产时利用率降低。

微生物在发酵过程中产生多种水解酶，可以将大分子化合物分解成人体更易吸收的小分子物质，增加生物利用率[4]。微生物发酵可以显著提升产品的感官品质，发酵产生的有机酸、多肽、甘氨酸、游离脂肪酸等对产品的口感和香气起着重要作用[5]。植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌间具有协同作用，植物乳杆菌降解杂粮中大分子物质，产生大量乳酸，酸性环境可维持嗜酸乳杆菌正常的细胞壁和细胞膜结构，而植物乳杆菌在发酵过程中合成的叶酸又可供给嗜酸乳杆菌生长[6]。徐安书等[7]选用植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌开发出具有保健功能的茎瘤芥保健饮料产品，提高茎瘤芥的附加值。赵丽娜等[8]用嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌混合发酵，旨在为开发一种富含益生菌和β-葡聚糖的功能性产品提供基础。

本研究以10种杂粮为原料制备杂粮代餐粉，采用复合菌种对原料进行发酵处理，探究发酵对杂粮代餐粉品质特性、抗氧化活性的影响。以期为确定杂粮代餐粉的发酵工艺参数提供有益参考，也为探究微生物发酵对杂粮代餐粉品质特性和抗氧化活性的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

紫罗兰紫薯、东北黄豆、红皮花生仁、黑芝麻籽、玉米(丹玉69号)、黄小米、长粒香糙米、白色藜麦、纯种小薏苡仁、青稞(肚里黄)。

植物乳杆菌JYLP-002、嗜酸乳杆菌JYLA-191；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、过硫酸钾均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JTM60胶体磨，Scientz-150高压均质机，SD-1500喷雾干燥机，CHROMA METER CR-400型色差仪，Q20-差式扫描量热仪。

1.3 方法

1.3.1 杂粮代餐粉的工艺流程

原料→胶体磨→50目过滤→灭菌→冷却→接种→发酵→高压均质→喷雾干燥→杂粮代餐粉

1.3.2 杂粮代餐粉的操作要点

取新鲜紫薯清洗、去皮、护色[9]，其余原料除杂、清洗、浸泡，将10种原料(紫薯108.00 g、黄豆58.00 g、花生仁57.00 g、芝麻籽9.78 g、玉米8.00 g、小米7.70 g、糙米5.47 g、藜麦4.50 g、薏米4.00 g、青稞3.00 g)加水(料液比为1∶6)后用胶体磨打浆并过滤[10]，再用高压灭菌锅121 ℃灭菌20 min，备用。把经过发酵的混合浆液进行高压均质(P=40 MPa，t=2～5 min)、喷雾干燥处理(喷雾压力0.20 MPa、进料流量400 mL/h、进风温度160 ℃、热风流量45 m3/h)，最后制得杂粮代餐粉。

1.3.3 菌种活化

将2个菌种的冻干粉溶于无菌水混匀，在MRS固体培养基中进行涂布，37 ℃培养24 h。取单菌落于MRS液体培养基中活化2次，以2%的接种量接种至MRS液体培养基中，培养12 h至菌体浓度为108CFU/mL。

1.3.4 单因素实验

分别固定接种比例为1∶1、发酵时间为11 h、发酵温度为34 ℃、接种量(菌质量分数)为3%，考察各因素对可溶性固形物的影响。将复合菌接种比例设定为0∶1、1∶2、1∶1、2∶1、1∶0，发酵时间设定为5、7、9、11、13 h，发酵温度设定为28、31、34、37、40 ℃，接种量设定为1%、3%、5%、7%、9%，不进行发酵处理的样品作为对照组。

1.3.5 正交实验优化

根据单因素实验结果，进行4因素3水平正交实验，确定杂粮代餐粉的最佳发酵条件，因素与水平如表1所示。

表1 正交实验因素与水平

1.3.6 可溶性固形物测定

取待测样品于70 ℃烘箱烘干至恒重，准确称取干燥后样品0.1 g并加入0.9 mL蒸馏水，配制成10%溶液，于100 ℃水浴30 min，再以3 000 r/min离心30 min[11]。

式中：A为样品中可溶性固形物质量分数/%；A0为溶液中可溶性固形物质量分数/%。

1.3.7 冲调性测定

以分散性和润湿性为考察指标测定冲调性[12]。

其中分散性的测定：称取1.0 g样品，并加入25 mL去离子水进行磁力搅拌(转速300 r/min)，记录样品全部分散于水中所用时间。

润湿性的测定：称取1.0 g样品，置于50 mL 50 ℃的去离子水中，记录样品在水中全部润湿所用时间。

1.3.8 色泽测定

以CIEL ab表色系统测定样品的L*(明-亮)、a*(红-绿)和b*(黄-蓝)值，根据所得数据，计算色度(C*)，色相角(H*)，总颜色(E*)，色差(ΔE*)和白度(W)。

C*=(a*2+b*2)0.5

E*=(L*2+a*2+b*2)0.5

W={100-[(100-L*)2+(a*2+b*2)]0.5}×100%

1.3.9 水合特性测定

称取0.5 g样品于20 mL蒸馏水并混合均匀，在25 ℃和100 ℃水浴30 min，然后高速离心30 min(转速10 000 r/min)[13]，倒出上清液烘干至恒重。

式中：m为样品质量/g；m1为离心管中沉淀的质量/g；m2为干燥至恒重的上清液质量/g。

1.3.10 持水力测定

准确称取0.25 g样品与25 mL去离子水于50 mL离心管中，摇匀后在室温下静置60 min，然后离心15 min(转速3 000 r/min)[14]。

式中：m0为样品质量/g；m1为离心管质量/g；m2为吸水后样品和离心管质量/g。

1.3.11 持油力测定

将0.5 g样品与4.0 g大豆油混合均匀，在37 ℃的水浴锅中静置4 h，离心15 min(转速4 000 r/min)[15]。

式中：m0为样品质量/g；m1为离心管中沉淀质量/g。

1.3.12 粉体特性测定

1.3.12.1 休止角及滑角的测定[16]

休止角(θ)：将漏斗底端固定在距离桌面(H)3 cm的铁架台上，在漏斗下端放置一张方格纸，再将样品匀速倒入漏斗，直至形成的锥体顶端接触到漏斗底部，测量锥体直径记作2R。

滑角(α)：称取5.0 g样品置于长(L)130 mm的玻璃板上，将平板一端缓缓抬起，记录样品开始下滑时平板的垂直高度(H)。

1.3.12.2 松密度(ρB)、轻敲密度(ρT)、卡氏指数(Carr)、霍斯纳比值(Hausner)的测定

ρB：取一个50 mL量筒，将样品缓缓倒入量筒中至20 mL标记处，准确称量样品倒入后量筒的质量。

式中：m1为量筒的质量/g；m2为样品与量筒的总质量/g；VB为注入样品的体积/mL。

ρT：然后用手轻敲量筒300次，记录敲击后样品体积。

式中：VT为敲击后样品的体积/mL。

Carr指数、Hausner比值按公式计算。

1.3.12.3 川北方程[17]

取样品缓慢倒入量筒至100 mL处，然后将量筒从垂直桌面1 cm高度处自由落下，直至体积不变，记录此时样品体积和落下次数。川北方程变形为：

式中：n为轻敲次数(即落下次数)；a为轻敲次数无穷大时体积减少数；b为充填速度常数；C为样品相对体积减小数。

轻敲次数无穷大时：

式中：V0为初始体积；Vn为轻敲n次后样品体积；V∞为轻敲无穷次后样品体积。

1.3.13 DSC糊化特性测定

称取样品5 mg于DSC铝盒中，温度范围20～200 ℃，升温速度为10 ℃/min，以密封空铝盒作为对照进行扫描。

1.3.14 抗氧化活性测定

提取液的制备[18]：准确称取1 g样品，用50 mL(每次25 mL)80%乙醇溶液作提取液，再用均质机5 000 r/min间歇破碎5 min，超声提取20 min，5 000 r/min离心15 min后取上清液，提取2次，合并、定容，4 ℃保存备用。

1.3.14.1 DPPH·清除率测定

将0.1 mL样品提取液与2 mL 0.2 mmol/L DPPH、2.9 mL无水乙醇混合并摇匀，然后放置暗处静置30 min，在517 nm处测吸光值[19]。

式中：Ac为用无水乙醇代替样品液时的吸光度；Aj为加样品，用无水乙醇代替DPPH时的吸光度；Ai为加样品与DPPH时的吸光度。

1.3.14.2 ABTS+·清除率测定

将ABTS溶液(7 mmol/L)与过硫酸钾溶液(2.45 mmol/L)以1∶1混合均匀，于室温下避光14～16 h，记作ABTS母液。用pH 7.4的磷酸盐缓冲液(浓度0.20 mol/L)将ABTS母液稀释至734 nm波长处的吸光值为0.72～1.20[20]。

取1 mL样品提取液与4 mL稀释后的ABTS溶液反应6 min，在734 nm处测吸光值。

式中：AC2、AS2分别为空白组和不同样品组的吸光值。

1.3.14.3 还原能力测定

将2.5 mL 0.2 mol/L PBS溶液 和2.5 mL 2%的铁氰化钾溶液加入到0.1 mL提取液中，50 ℃水浴20 min，再加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，摇匀，5 000 r/min离心10 min。吸取2.5 mL上清液并依次加入0.5 mL 0.1%三氯化铁和2.5 mL蒸馏水，静置10 min，于700 nm波长处测吸光值[21]。

1.4 数据处理

每组实验重复3次，实验数据以平均值±标准差表示，采用Origin pro 2018作图，使用SPSS 26.0中单因素ANOVA检验进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

可溶性固形物以可溶性糖类为主，还包括有机酸、维生素、矿物质等营养物质[22]。可溶性固形物与发酵进行程度、发酵产生的可溶性糖和有机酸等营养物质呈正相关。图1为接种比例、发酵时间、发酵温度、接种量对杂粮代餐粉可溶性固形物的影响。

图1 接种比例、发酵时间、发酵温度、接种量对杂粮代餐粉的可溶性固形物影响

植物乳杆菌与嗜酸乳杆菌的比例为1∶2时，可溶性固形物达到最大值。2个菌种的接种比例从0∶1到1∶0，可溶性固形物先上升后下降，因为植物乳杆菌添加量的增加促进了两菌种间的协同作用，可溶性固形物上升，而过多的植物乳杆菌又会与嗜酸乳杆菌产生拮抗作用，形成竞争关系，从而抑制发酵的进行，可溶性固形物减少。

随着发酵时间的增加，可溶性固形物先增大后减少。可能因为随着底物中碳源和氮源的减少，菌种正常代谢受阻，导致植物乳杆菌和嗜酸乳杆菌生长缓慢，菌种活性的减弱进而导致可溶性固形物溶出速度减慢，最后达到饱和，即7 h处。7 h后随着乙醇等微生物发酵产物的积累，致使可溶性固形物所占比例减少。

发酵温度在28～37 ℃之间时，可溶性固形物直线上升，37 ℃后呈下降趋势。可能因为适宜的温度提高两个菌种的繁殖速率，菌种良好的代谢可以更好地降解植物细胞壁并释放可溶性固形物[23]。当发酵温度低于37 ℃菌种代谢活动缓慢，可溶性固形物较小，高于37 ℃代谢活动又受到抑制，只有发酵温度在37 ℃时，菌种才能达到最适生长温度，此时可溶性固形物越大含量最高。

随接种量增加，可溶性固形物呈先上升后下降趋势。这可能是由于微生物生长受碳源和氮源影响，菌种只有在底物充足的条件下才能稳定生长[24]。在接种量为7%时可溶性固形物达到最大值，说明此时活菌数较多，乳杆菌对底物反应充分。接种量继续增加，菌种间产生竞争作用使生长繁殖受到抑制，导致菌种对底物反应不充分，可溶性固形物含量降低。

2.2 正交实验结果

根据预实验和单因素实验结果，以可溶性固形物和冲调性为指标，利用L9(34)正交实验进行工艺优化。利用加权系数法赋予各指标权重分别为可溶性固形物占40%，冲调性占60%。按公式计算[25]：

综合分=A1×40%+A2×30%+A3×30%

式中：A1为可溶性固形物隶属度；A2为分散时间隶属度；A3为润湿时间隶属度。

如表2可知，各因素对杂粮代餐粉的综合分影响主次顺序为D>B>C>A。取得综合分最大时的组合A3B2C1D3为最优组合。

表2 正交实验设计与结果

由表3可知，接种量对杂粮代餐粉的综合分影响显著(P<0.05)，发酵时间、发酵温度和接种比例影响不显著且对综合分的影响程度依次递减。

表3 方差分析

2.3 色泽测定结果

色泽是反映产品品质的重要指标之一，其中色度C*表示颜色的色调和饱和度，色度值升高，颜色越深。如表4所示，样品组色度小于对照组，说明样品组颜色更浅。两样品色相角H*相差不大，样品组的总颜色E*比对照组增加了29.28%。色差ΔE是用数值方式表示两颜色之间色彩的差别，发酵使ΔE减小，说明样品组与标准白板相比色泽变化更小，颜色更亮。白度W可以量化色泽的变化，样品组与对照组相比增加了33.18%，可能由于菌种生长繁殖等原因导致产品白度发生改变[26]。

表4 发酵对杂粮代餐粉色泽的影响

2.4 水合特性测定结果

吸水指数反映了粉体的糊化程度。由表5可知，经过发酵处理的杂粮代餐粉吸水指数下降。与对照组相比，样品组的水溶性显著增加，25 ℃和100 ℃分别增加了1.38、1.42倍。这可能是因为样品经发酵处理后淀粉等大分子化合物被分解成小分子物质，比表面积增大，易于水溶性物质溶出。另外，发酵处理可能会使部分不溶于水成分的价键发生断裂，从而转化为可溶性物质。膨胀势反映了淀粉悬浮液在糊化过程中的吸水性和离心后的持水能力[27]。对照组相比，样品组膨胀能力显著提高。

表5 发酵对杂粮代餐粉水合特性的影响

2.5 持水力、持油力测定结果

由图2可知，样品组的持水力与对照组相比显著增强，持油力减弱。这是由于发酵处理使杂粮代餐粉的内部结构发生部分降解而变得疏松，表面羧基、羟基等亲水基团暴露[28]，从而使持水力变大；而油脂与其接触面积减小，导致持油力变小。

图2 发酵对杂粮代餐粉持水力和持油力的影响

2.6 粉体特性测定结果

松密度和轻敲密度主要与颗粒大小、形状，以及颗粒间的黏附趋势和孔隙率有关[29]，密度越大，填充性越好。如表6可知，杂粮代餐粉经发酵处理后松密度与轻敲密度均增加。休止角和滑角反映了粉体的流动性，角度越小，流动性越好，流动性好的产品可以增加其稳定性、混合后不易分层[30]。样品组的休止角和滑角均比对照组小，说明样品组的流动性更好。经过发酵处理的杂粮代餐粉Carr指数和Hausner比值分别减小了32.75%、9.77%。说明发酵可以提高粉体的流动性，对产品在生产和运输中具有重要意义。

表6 发酵对杂粮代餐粉粉体特性的影响

一般认为，a值越小，粉体的流动性越好；1/b值越小，粉体的填充速度越大，填充更易于进行。由表7可知，样品组a值和1/b均小于对照组。这表明样品组的流动性和填充性均较对照组有所提升。

表7 川北方程拟合参数结果

2.7 DSC测定结果

由表8可知，样品组的糊化起始温度T0低于对照组，这说明经过发酵处理的杂粮代餐粉更易于糊化。与对照组相比，样品组热焓值ΔH增加，可能因为发酵使直链淀粉含量增加，其溶出利于脂类与其结合形成复杂的双螺旋结构，进而增加了糊化过程中所需的热量。

表8 杂粮代餐粉的DSC变化的热分析数据

2.8 抗氧化活性测定结果

由表9可知，与对照组相比，样品组的DPPH·清除率和ABTS+·清除率均提高。此外，发酵对产品的还原能力也有所提升。研究表明，发酵产品具有较强的抗氧化活性，主要原因为：一是菌种产生的酶与不同基质发生反应而具有抗氧化性，二是发酵使氨基酸转氨生成α-酮酸，进一步降解产生醛类、羧酸等抗氧化活性物质[31]。

表9 杂粮代餐粉的抗氧化性测定结果

3 结论

本研究以杂粮为原料，利用正交实验对杂粮代餐粉发酵条件进行优化，探究了发酵对产品的品质特性、抗氧化活性的影响。结果表明，杂粮代餐粉最佳发酵条件为：接种比例1∶1，发酵时间7 h，发酵温度34 ℃，接种量9%。通过对杂粮代餐粉品质特性的进一步研究，发现发酵对杂粮代餐粉色泽影响显著；经发酵处理的杂粮代餐粉吸水指数减小，水溶性、膨胀势、持水力增强，持油力减弱；粉体流动性和填充性均得到改善；更加易于糊化；DPPH·清除率、ABTS+·清除率、还原能力提高。