三阴性乳腺癌中溶酶体相关膜蛋白-2表达水平的临床意义及预后价值

阿孜古丽·阿布都热合曼,李宇翔,赵寰宇,朱丽萍

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率高居我国女性恶性肿瘤中的第1 和第4位[1]。其中，三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)和人表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor 2,HER2)均为阴性的乳腺癌,约占所有类型乳腺癌中的15%～20%[2]。TNBC 最常见的组织学类型为浸润性导管癌，TNBC 细胞的增殖转移不受雌激素及其受体调节，具有高度异质性和侵袭性，预后较其他类型乳腺癌差。TNBC患者中位生存期约为13 个月[3]，即使接受乳腺癌根治性切除术及化疗、放疗综合治疗后的患者，也常于术后3 年内出现复发、转移[4]。因此，早诊断早治疗对患者的预后具有极其重要的意义。

溶酶体相关膜蛋白(lysosome-associated membrane protein,LAMP)家族是类高度糖基化的跨膜蛋白，包括LAMP1、LAMP2、LAMP3、CD68/Macrosialin/LAMP4、BAD-LAMP/LAMP5 五个成员。其位于溶酶体膜上，溶酶体是真核细胞中的酸性细胞器，最初被认为是唯一能将细胞内和细胞外的大分子降解为可用的成分的细胞器[5-6]。直到通过不断的研究才被认为是细胞稳态的关键调节因子，越来越多的证据表明它们与神经退行性疾病、心血管疾病等多种疾病有关[7]，也有研究发现多种恶性肿瘤存在着LAMP 异常表达，认为其LAMP 水平与肿瘤的严重程度呈现正相关[8-9]。本研究分析溶酶体相关膜蛋白-2（LAMP2）表达水平与临床病理特征和预后之间的关系，为三阴性乳腺癌的发生机制、预后评估及精准治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 一般资料 收集2015 年1 月-2017 年1 月在新疆医科大学附属肿瘤医院行乳腺癌根治术的104例TNBC 患者临床及病理资料，对照组采用同一患者距肿瘤边缘＞5 cm 的癌旁组织。104 例TNBC 患者均为女性，年龄35-72 岁，中位年龄54岁，Ⅰ期18 例，Ⅱ期55 例，Ⅲ期31 例。有淋巴结转移49 例。纳入标准：①符合TNBC 诊断标准的女性患者；②所有组织标本均在离体2 min 内在液氮及-80 ℃冷藏；③术后病理结果为浸润性导管癌；④术前未接受化疗、放疗、内分泌治疗。排除标准：①非原发性肿瘤；②伴有其他部位的恶性肿瘤；③临床资料缺失或失访。本研究得到了新疆医科大学附属肿瘤医院医院伦理委员会的批准，所有患者均知情同意。

1.2 方法 收取104 对癌组织和癌旁组织，严格按照全蛋白提取试剂盒说明书，在冰上配制溶液和研磨组织，加入含蛋白酶抑制剂的RIPA 裂解液进行裂解，12 000 g/min 离心20 min，留取上清制备蛋白溶液。按照BCA 试剂盒说明书进行标准平配制、稀释和检测完成蛋白浓度的测定，按照5×缓冲液:提取蛋白=1:4 加入缓冲液，在100 ℃下煮10 min 变性。按照BCA 测定结果加入SDS-PAGE 凝胶，恒流电泳,电泳完成后转移到NC 膜上，5%的脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗孵育过夜，TBST 清洗3 次,每次10 min，一抗孵育结束后，与特定浓度的二抗进行孵育结合。二抗带HRP 或AP 标记。二抗回收用PBST 洗涤5min×5 次化学发光显影，曝光/成像。纯水洗涤5-7次，膜上滴加显影液放置2-3min，曝光成像获取图片。Image J 分析蛋白的相对浓度后GraphPad Prism 8绘图。

1.3 随访 采用定期门诊复查、电话随访、入院复查记录的方式进行随访，随访起始时间为患者术后出院时间，终止时间为死亡日期，截至2022年1月，中位随访时间为66 个月，所有患者均获得有效随访资料。

1.4 统计学处理 采用SPSS25.0 软件进行数据统计分析，GraphPad Prism8.0 辅助作图。连续性变量用中位数及四分位间距表示，组间差异采用配对样本t检验进行比较。分类变量以各类别的例数和百分比表示，组间差异采用χ2检验进行分析。采用Kaplan-Meier 法进行生存分析，两组间生存率的比较采用Log-rank检验进行。采用Cox比例风险回归模型进行单因素和多因素分析。

2 结果

2.1 LAMP2 蛋白的表达在TNBC 患者癌组织、癌旁组织中的表达水平 使用Western-Blot 检测采集的104对冻存组织样本中LAMP2的表达水平，癌组织中LAMP2 的相对表达水平(1.581±0.412)高于癌旁组织(0.705±0.305)，差异有统计学意义(t=5.935，P＜0.05，图1、图2)。

图1 LAMP2在4对肿瘤-癌旁组织中的表达（T,TNBC组织；N,癌旁组织；GAPDH 为内参；4例代表性样本）

图2 104例TNBC组织及对应的癌旁组织中LAMP2 蛋白的相对表达水平

2.2 LAMP2 表达水平与TNBC 患者临床病理特征的关系 将104例TNBC患者按LAMP2相对表达水平分组，以LAMP2 在癌组织中相对表达水平均数1.581为界限值，高于均数的患者纳入高表达组，低于均数为低表达组。TNBC组织中LAMP2高表达与淋巴结转移(χ2=4.669，P=0.031)、组织学分级(χ2=8.847，P=0.003)、TNM分期(χ2=11.158，P=0.004)相关，LAMP2与患者年龄、月经状态无相关性。见表1。

表1 TNBC组织中LAMP2蛋白表达水平与临床病理特征的关系

2.3 LAMP2 表达与TNBC 患者预后的关系 104例TNBC 患者中死亡32 例，5 年生存率为69.5%。其中，LAMP2 高表达组52 例，死亡21 例，5 年生存率为61.0%；低表达组52 例，死亡6 例，5 年生存率为89.9%，两组间生存率存在显著差异(P＜0.05，图3)。Cox 比例风险回归模型单因素分析显示：肿瘤分期(P＝0.002)、淋巴结转移(P＝0.005)、LAMP2 表达水平(P＝0.005)与TNBC 患者OS显著相关。多因素分析结果显示，肿瘤分期(HR:2.408；95%CI：1.323～4.382；P=0.004)、LAMP2表达(HR: 2.851；95%CI:1.311～6.200；P=0.008)是TNBC 患者OS 的独立预测因素(表2)。

表2 三阴性乳腺癌患者总生存单因素分析

图3 LAMP2高表达组和低表达组TNBC患者的生存分析曲线

表3 三阴性乳腺癌患者总生存多因素Cox回归分析

3 讨论

LAMP2是LAMP家族中的一员，属于真核酸性细胞器溶酶体合成的蛋白，它最初被定义为参与细胞内和细胞外大分子降解的小分子蛋白，近期文献报道，认为它是维持细胞稳定的关键调节因子，并且有越来越多的证据证实它参与很多疾病的产生与发展，如神经退行性疾病、心血管疾病以及癌症[8,9]。

多项研究表明，大多数LAMP2 蛋白存在于细胞核周的溶酶体和晚期核内体中，而一小部分LAMP2 蛋白在质膜、核内体和溶酶体之间动态穿梭[10-11]。然而，一些学者认为在癌细胞中，特别是具有侵袭性表型的癌细胞中，溶酶体的分布转变为从核周向外周模式转移，从而释放溶酶体内容物，促进其迁移，侵袭或转移[12-15]。在乳腺癌的表型中，TNBC 具有高侵袭性、高复发率、年轻化、预后差等独特的生物学特征，本研究通过对TNBC 患者癌组织、癌旁组织进行LAMP2 差异表达分析，并通过WB 实验将LAMP2 相对表达量1.581 设为界限值，将患者分为高表达组与低表达组，通过患者临床病理特征及预后分析，探讨了其在TNBC 的表达对患者淋巴结转移、TNM 分期和生存预后的关系，进一步证实了LAMP2 在TNBC 中高表达可能代表着其更强的侵袭性、转移能力和更差的预后状态。

中国的Li 和时帅等[16,17]进行了多种恶性肿瘤LAMP2 蛋白表达的研究，与正常组织相比，LAMP2蛋白在低分化的胃腺癌、肝细胞癌、唾液腺样囊性癌以及肺腺癌患者支气管肺泡灌洗液中也有较高的表达，预示着LAMP2 可能成为一个新的恶性肿瘤分子标记物。也有研究提示LAMP2 蛋白参与了结直肠癌的发生和演进过程[18]，该研究结果显示结直肠癌和腺瘤中LAMP2 蛋白表达高于正常黏膜（P＜0.05），单因素生存分析结果为：血管浸润、淋巴管浸润、TNM 分期、淋巴结转移远处转移、、肝转移、分化程度与结直肠癌患者预后不良呈现正相关。多因素风险回归分析结果显示浸润深度和远处转移会缩短患者生存时间，是重要的危险因素。本研究课题组前期研究在乳腺癌差异基因拷贝数[19-20]以及富集基因分析中筛选出与TNBC 生物学行为高度相关的分子蛋白，其中LAMP2 在富集基因关系网中处于相对集中位置，推测LAMP2可能与TNBC 的发生发展有联系。本研究结果示：在TNBC癌组织中LAMP2蛋白高表达，并与淋巴结转移、组织学分级及肿瘤学分期相关，也进一步佐证了LAMP2 蛋白可能参与了TNBC 的疾病发生和进展。本研究样本量较少，无法完全代表TNBC 中LAMP2 的表达水平，后续进一步扩大样本量后继续研究，证明LAMP2是否能成为TNBC的一个新的分子标记物。

Ming等[21]研究发现食管癌组织中存在LAMP2高表达，其表达水平与食管癌患者生存预后相关，LAMP2 表达阳性的食管癌患者总生存率和疾病无进展生存率均显著降低低表达者，提示LAMP2 与预后呈现负相关。本研究中对TNBC 患者进行了单因素、COX 多因素预后分析发现，LAMP2 高表达是TNBC 患者OS 的独立危险因素(独立预后因素)。在5 年的随访过程中104 例TNBC 患者中共死亡32例。其中，LAMP2 高表达组5 年生存率为61.0%；低表达组5 年生存率为89.9%，差异有统计学意义。本研究通过对患者预后分析，发现LAMP2 表达越高可能代表着TNBC 患者预后水平更差。随着分子特征、信号通路和机制在研究和临床试验中的广泛研究，我们期待未来能找到更多有效的生物标志物和治疗靶点用于TNBC患者的辅助治疗。

综上所述，LAMP2 在TNBC 癌组织中高表达，可能预示更高的肿瘤恶性度和不良预后。LAMP2有望成为TNBC 预后评估的新生物标志物和精准治疗的新靶点。