β-谷甾醇靶向调控PI3K3CG基因保护心肌肥厚作用研究

李鹏宇，陈梦真，冉嘉欣，刘思宇，孙辉

心力衰竭（heart failure,HF）是一种严重威胁人类健康的心脏疾病，且发病率正逐年上升[1]。心肌肥厚是心力衰竭的重要病理生理过程之一[2]。心脏及心肌细胞增大导致心室壁张力降低，为保持心脏效率和输出量致使心肌工作量增加或心脏损伤，引起器官结构的破坏并导致心力衰竭[3]。因此，新的心肌肥厚的治疗药物和潜在治疗靶点将为心血管疾病的预防和治疗提供新方法。

中药网络药理学（Pharmacology database and analysis platform of traditional Chinese medicine system,TCMS）是将生物信息学、计算生物学及靶向药理学的方法整合成一种新的研究思路，其研究思路具有全局性和系统性的特点[4]。通心络是由7 种不同君药及5 种不同的臣药制成的一种复方中药[5]，广泛应用于心血管疾病的治疗，可以稳定动脉粥样硬化斑块、降低血脂水平、改善内皮功能、促进血管扩张、抑制炎症和凋亡，并促进血管生成[6]。然而，通心络对于心肌肥厚的作用尚不清楚，尤其是通心络中何种关键因子起到保护作用尚不明确。

β-谷甾醇（β-sitosterol）是青蒿属植物的有效成分，已被用于预防三硝基苯磺酸诱导的小鼠结肠炎[7]。β-谷甾醇具有良好的抗氧化剂或营养添加剂[8]。一项研究报道了β-谷甾醇通过抗氧化及降低血糖逆转由链脲佐菌素诱导的糖尿病发生[9]。因此，本研究基于网络药理学研究方法分析通心络各成分靶点及药物机理，探讨β-谷甾醇在心肌肥厚中的作用。

1 材料与方法

1.1 通心络的化学组成 本研究采用计算系统生物学实验室的中药系统药理学数据库和分析平台(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索通心络中人参、赤芍、檀香、降香、乳香、酸枣仁以及冰片7 味药的成分。

1.2 筛选阈值

1.2.1 候选化合物筛选 将中药人参、赤芍、檀香、降香、乳香、酸枣仁、冰片的化合物口服生物利用度(OB)筛选阈值设为OB≥30%，7味中药的类药性(DL)阈值设为DL≥0.2及肠上皮通透性(Caco-2)阈值设为Caco-2＞-0.4，最终筛选出95个候选化合物。

1.2.2 构建化合物-靶点网络 采用TCMSP 数据库获得通心络小分子化合物对应的靶点名称，应用Uniprot 数据库将靶点基因全称转化为gene ID 号，从而通过Cytoscape 3.7.2软件构建出通心络的高活性化合物-靶点网络，进行通心络药理学作用机制深入探究。并通过Cytoscape 3.7.2软件构建出人参这味中药的高活性化合物-靶点网络。

1.2.3 基因本体（GO）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 将获得的数据中的β-sitosterol 活性分子采用GO 功能和KEGG通路对靶基因进行富集分析，以此阐明中药化合物的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

1.3 材料 异丙肾上腺素（Isoproterenol，ISO，鹤峰药厂，上海，中国）。β-谷甾醇（阿拉丁，上海，中国）。ANP、BNP、PI3K3CG 和β-MHC 相应引物（生工生物工程技术服务有限公司，上海，中国）。

1.4 心肌细胞培养与处置 H9C2 心肌细胞（中国细胞库，上海，中国），在含有10%胎牛血清（赛默飞世尔，美国）的DMEM（海克隆，美国），其中含有100单位/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素。置于37 ℃，含有5%CO2的湿空气恒温孵箱中培养备用。待细胞对数期生长至60%～70%后，将10 μM ISO 加入心肌细胞中，诱导其成为心肌肥厚模型。同时，将不同浓度的β-谷甾醇加入到ISO 诱导的心肌细胞中，（正常组，ISO 组，ISO+β-谷甾醇（0.01～1.0 mM）以及单独β-谷甾醇组）24h。

1.5 心肌肥厚模型的建立 使用健康的Sprague-Dawley 的雄性大鼠（180～200 g）。动物的住房条件（温度21+2℃，湿度55%～75%），12 h 暗/光循环，无食物和水的限制。所有实验程序均由哈尔滨医科大学伦理委员会证明（伦理号：IRB3015722）。经过5 d 的静态处理，经头颈部皮下注射ISO（每天2.5 mg/kg）或者β-谷甾醇（每天0.5 mg/kg）用于14 d。对照组注射等量的生理盐水。

1.6 心肌细胞表面积的测定 不同组细胞采用4%多聚甲醛固定15 min，然后将H9C2 细胞通过0.4%TritonX-100 固定90 min，山羊血清室温封闭90 min。接下来，心肌细胞结构染色，然后采用荧光显微镜（Nikon80i，日本）进行拍照。通过Image J 数据软件对于心肌细胞面积进行测定。

1.7 荧光定量PCR 用TRIZOL 提取心肌细胞以及心肌组织中的总RNA。通过ABI7500 快速实时定量PCR 系统（Applied Biosystems，美国）检测心肌细胞以及心肌组织中的心钠素（Atrial Natriuretic Peptide,ANP），B 型利钠肽（B-type natriuretic peptide,BNP）以及β-肌球蛋白重链（β-myosin heavy chain，β-MHC）的表达，ANP，BNP 以及β-MHC 的序列如下：

1.8 H&E 染色 将大鼠的心脏采用0.9%的生理盐水冲洗干净后，固定在10%福尔马林，待固定完成后，将心脏组织切片至7 μm，苏木精染色及曙红（H&E）。心肌细胞的横断面，在400 倍放大率下检测心肌细胞肥大面积。细胞横切面面积测定通过magePro-Plus4.0系统。

1.9 超声心动评价心功能 心脏功能评估是使用Vevo2100 图像采集系统（Visualsonics，多伦多，加拿大）配备30 mHz 微扫描传感器。在胸骨旁长轴和短轴上均记录了M 型追踪。测量QT间期和R间期，以及心率校正用Bazett 公式：QTc/QT/（RR）1/2，接受方法修正qt间期。

1.10 统计学处理 所有实验数据使用SPSS 22.0软件进行统计分析，计量资料使用均数±标准差（）表示，两组间的比较采用独立样本t检验，多组之间比较采用方差分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 筛选活性化合物 药物的口服生物利用度（OB）是药理学中最重要的药代动力学参数之一，它反映所给药物进入人体循环的药量比例，高OB值一般是决定生物活性分子类药性（DL）的关键指标。Caco-2细胞模型是一种人克隆结肠腺癌细胞，结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系。可以用来研究药物吸收的潜力，药物运转的机制，以及研究药物、营养物质、植物性成分的肠道代谢，目前也是一种常用的评价药物渗透性的指标。本研究从TCMSP网站下载了这些化合物的OB、DL和Caco-2指标来共同筛选其中潜在的高活性化合物。为了使筛选的化合物具有代表性，同时要从整体上反映通心络的药理学特性，7 味中药的OB、DL 和Caco-2 阈值设为OB≥30%，DL≥0.2，Caco-2＞-0.4。将通心络的7味中药中的化合物通过筛选，得到95个活性成分作为候选化合物。其中有21 个化合物来自人参，20个来自赤芍，2个来自檀香，37个来自降香，8个来自乳香，8个来自酸枣仁，3个来自冰片（表1）。而，β-谷甾醇作为主要成分在人参，赤芍以及降香中均有出现，且出现频率最高。

表1 通心络人参活性成分

2.2 化合物-靶点相互作用网络 采用Cytoscape 3.7.2软件构建的化合物-靶点网络共包含248个节点（68个化合物节点，180个靶基因节点）和1034条边，连接化合物与靶点对应的基因表示他们之间有作用关系（图1）。由于在TCMSP 数据库中并没有找到冰片中的活性成分对应的靶点，因为图1 中包含了通心络7种成分的化合物-靶点网络。

图1 通心络有效成分-靶点网络不同形状图形代表了不同成分来源

随后，对于通心络的君药“人参”的活性成分，利用Cytoscape 3.7.2 软件构建的化合物-靶点网络，共包含125个节点（16个化合物节点，109个靶基因节点）。通过查阅文献发现这些活性成分中，β-谷甾醇可能是潜在的抗心肌肥厚活性成分。故，在后续的研究中，主要以β-谷甾醇为主要研究对象。

2.3 GO 富集与通路富集分析 将通心络中名为β-谷甾醇的活性成分所对应的靶基因映射到DAVID数据库中，进行GO 生物学功能分析和KEGG 富集分析，以FDR 校正值作阈值进行筛选，共获得43 个GO 条目和28 条KEGG 通路。在富集GO 条目中，与分子功能有关的条目6 个，涉及神经递质受体的活动、跨膜受体的活动、跨膜信号受体活性、被动跨膜转运蛋白活性、底物特异性跨膜转运蛋白活性；与生物过程有关的条目27 个，涉及循环系统过程、细胞对化学刺激的反应、对有机物的反应、信号转导、药物反应、对含氧化合物的反应等方面；与细胞组成有关的条目10 个，包含原生质膜的组成、质膜的固有成分、等离子体膜、细胞边缘、神经元、突触后膜等方面。富集的KEGG 通路包括神经活性配体-受体相互作用信号通路、钙离子信号通路、胆碱能突触信号通路、含血清素的信号通路以及cAMP信号通路等。

2.4 β-谷甾醇减弱ISO 诱导 H9C2 细胞表面积增加 采用ISO（10 μM，48 h）诱导H9C2 细胞构建体外的心肌肥厚模型，通过肌动蛋白α 染色法检测心肌细胞肥大。如图2A 所示，ISO（10 μM，48 h）明显诱导心肌细胞表面积增加。β-谷甾醇0.01、0.05、0.1 和1.0 mM 作用24 h 能够明显抑制ISO 诱导的心肌细胞面积的增加。

图2 β-谷甾醇对H9C2细胞表面积的影响

通过qRT-PCR 检测心肌肥厚相关蛋白ANP（图3A），BNP（图3B）以及β-MHC（图3C）的mRNA表达，结果表明，β-谷甾醇能够逆转由ISO 诱导的ANP，BNP以及β-MHC的表达上调。

图3 β-谷甾醇对ISO诱导的H9C2细胞中肥大标志物的影响与对照组比较，*P＜0.05，正常组与ISO组比较，#P＜0.05，β-谷甾醇与ISO组相比。

2.5 β-谷甾醇抑制ISO 诱导的心肌肥大后大鼠心脏重构 通过在体实验验证β-谷甾醇对于心肌组织的影响。结果如图4A 所示，与对照组比较，ISO组心脏/体重比明显升高，而β-谷甾醇能够降低由ISO 诱导的心脏/体重比升高及降低由ISO 诱导的左心房/体重比（图4B）。H&E 染色结果表明β-谷甾醇能够降低由ISO 诱导的心肌细胞面显增大（图4C）。超声心动图评价大鼠心功能不同的治疗方法，如表1 所示，心动超声结果显示了LVAWd 和LVPWd与对照组比较，ISO 组大鼠心脏舒张功能明显降低（P＜0.05）。通过qRT-PCR 检测心肌细胞肥大标志物ANP（图5A），BNP（图5B）及β-MHC（图5C）的mRNA 表达，结果显示ISO 组能够明显增加心肌组织中ANP，BNP 以及β-MHC 的表达，而β-谷甾醇能够逆转由ISO诱导的ANP,BNP及β-MHC的表达上调。2.6 β-谷甾醇通过调控PI3K3CG 逆转ISO 诱导的心肌细胞肥大 通过Western blot 以及qRT-PCR 方法检测心肌组织以及H9C2 细胞中PI3K3CG 的表达，结果显示ISO 能够使H9C2 以及心肌组织中PI3K3CG 表达升高，而β-谷甾醇能够降低由ISO 诱导的PI3K3CG表达上调（图6 A-B）。

图4 β-谷甾醇对心肌肥厚模型大鼠的HW/BW（A）和LVW/BW（B）的作用，每组3-6只大鼠。（C）H&E 染色（400倍放大镜）以及不同组的横截面积数据，n=4-5只大鼠。与对照组比较，*P＜0.05，正常组与ISO 组比较，#P＜0.05，β-谷甾醇与ISO 组相比，ISO（2.5 mg.kg-1.d-1，持续10 d）；β-谷甾醇（1.5 mg.kg-1.d-1，持续10 d）。

图5 β-谷甾醇对ISO诱导的大鼠心肌肥厚模型中肥大标志物的影响

表2 大鼠心功能参数

图6 β-谷甾醇逆转由ISO诱导的心肌组织以及H9C2细胞中PI3K3CG表达

3 讨论与结论

通心络，是一种具有益气活血，通络止痛功效的中成药，临床中用于气虚血瘀络阻型中风病以及心脑血管疾病的治疗。本研究基于网络药理学方法，首先构建了通心络主要成分的化合物-靶点网络（图1）。在筛选的过程中，我们发现β-谷甾醇可能是通心络中主要作用药物。有文献证明，β-谷甾醇可调控N-二乙基亚硝胺的表达亚硝酸铁诱导的大鼠急性肾毒性有促进作用[11-12]。β-谷甾醇还可通过诱导线粒体谷胱甘肽氧化还原循环过程，逆转由四氯化碳诱导肝毒性[13-14]。为了进一步探究β-谷甾醇作用的关键靶点，通过基因功能以及信号通路富集后，结果表明这些靶点的分子功能主要体现在跨膜受体活性，调控转运等。而对KEGG 通路富集分析的结果说明，除了一些癌症相关通路之外，这些靶点也富集到了钙信号通路。而钙离子通路在多种心脏相关的疾病中起着重要的作用，如细胞内钙离子信号通路是阿托伐他汀减轻心肌肥厚的重要通路之一[15]。钙离子信号通路参与FGF23 对于血管紧张素II 介导的心肌肥厚[16]。基于以上的结果证明我们前期对于下游通路的筛选是可靠的。同时，进一步对β-谷甾醇的下游的作用靶点进行深入挖掘，发现一些关键靶点，如PI3K3CG。以往的报道表明，PI3K3CG作为一个抑制因子参与了心脏GSK-3的表达[17]。PI3K3CG促进心肌梗死后的梗死面积增加并预防心肌梗死后的不良重塑[18]。结合以上结果，PI3K3CG 可能是β-谷甾醇保护心肌肥厚的重要作用靶点。随后，通过体内、体外实验证明β-谷甾醇能够抑制ISO 诱导的心肌肥厚的发生，使ANP，BNP 以及β-MHC 的表达降低，且通过调控PI3K3CG基因实现的。

综上，我们的结果基于网络药理学分析通心络的主要抗心肌肥厚活性成分，随后分子生物方法证实β-谷甾醇是主要的有效成分，且能够干预心肌肥厚的病理、生理过程，阻断其恶性进展，能够给通心络以及β-谷甾醇提供更好的应用价值以及理论基础。