华蟾素联合阿霉素对脑胶质瘤细胞增殖、体外侵袭能力的影响及机制研究

李亚明，张智峰，刘 霞

(1.郑州大学第一附属医院神经外科,河南 郑州450052；2.徐州市第一人民医院病理科，江苏 徐州221600)

当前，恶性肿瘤已跃居危害人类健康疾病的榜首，很多肿瘤患者就诊时已处于中晚期，手术加放化疗是治疗首选，如何减弱化疗药物的不良反应，提高患者以后生存质量是亟待解决的重点，前期实验中我们发现华蟾素(Cinobufacin)联合阿霉素(Dox)对脑胶质瘤治疗具有可行性，两者联合可提高脑胶质瘤U251细胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表达，加速脑胶质瘤U251细胞的凋亡。华蟾素不仅可直接作用肿瘤细胞，还可提高阿霉素对脑胶质瘤U251细胞的敏感性及抗肿瘤的效用，且减弱阿霉素的不良反应。华蟾素联合阿霉素作用脑胶质瘤U251细胞对其增殖和体外侵袭能力影响如何？本实验继续深入研究。肿瘤患者死亡的最主要因素之一是肿瘤侵袭、转移导致的，桩蛋白(Paxillin)基因是致瘤性酪氨酸激酶的一种底物，具有调节细胞移动和播散等功能，进而能够提高肿瘤细胞转移、侵袭的能力[1-2]。多项研究报道Paxillin参与动态调节黏着斑、是一种重要的细胞黏附因子，可调节细胞的移动、诱导细胞恶性转化和播散[3-5]。肿瘤的浸润转移和预后与细胞的黏附力、移动力的改变密切相关，这提示Paxillin在肿瘤细胞的浸润、转移中起着关键作用[6-8]。本研究探讨华蟾素联合阿霉素能否降低Paxillin基因在脑胶质瘤U251细胞中的表达，以观察Paxillin基因表达下调后脑胶质瘤U251细胞体外侵袭能力的变化，同时检测各个作用组脑胶质瘤U251细胞中局部黏附斑激酶(Focal adhesion kinase,FAK)及基质金属蛋白酶2(Matrix metallo proteinases-2,MMP-2)基因、蛋白的表达水平的差异，为脑胶质细胞瘤侵袭机制的研究提供新的思路，并为其临床分子靶向治疗提供实验理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 脑胶质瘤U251细胞株由郑州大学病理教研室提供，培养在含RPMI-1640的培养液中(37 ℃、5% CO2、10%胎牛血清，100 mg/ml链霉素、青霉素)常规传代观察培养。阿霉素和华蟾素注射粉剂(R034347-25，Z34020273)、胎牛血清、RPMI-1640、ECL显色试剂盒、 兔抗人Paxillin、FAK和MMP-2抗体均购自美国Santa Cruz公司

1.2 实验方法

1.2.1 各组细胞组织形态观察：先用胰酶消化处理脑胶质瘤U251细胞成3×104/ml的单细胞悬液，再分成四组，均接种在96孔板上。阿霉素组：每孔依次滴加0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素(各浓度均设6个复孔)；华蟾素组：每孔依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml的华蟾素(各浓度均设6个复孔)；联合组：每孔依次滴加0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和 10.00 μg/ml的华蟾素(各浓度均设6个复孔)；对照组：每孔依次滴加上述分组同剂量的RPMI-1640培养液作用脑胶质瘤U251细胞。将上述分组细胞置入37 ℃、5% CO2的培养箱培养48 h后弃上清液取出96孔板中的盖玻片，放至倒置显微镜下观察细胞的生长情况、形态学变化。

1.2.2 各组细胞增殖抑制率检测：将分组的细胞培养24、48、72 h后加入MTT 20.00 μl(5.00 mg/ml)，继续培养4 h后终止并弃掉上清液，加入DMSO 200 μl/孔振荡摇匀10 min后上调节酶标仪检测，计算波长570 nm(空白对照组调零)比色下的OD值，检测药物半数抑制浓度(IC50)和细胞增殖抑制率。IC50=lg-1[Xm-i(ΣP-0.5)]3。细胞生长抑制率(%)=(1-实验孔平均OD值/对照孔平均OD值)×100% 。

1.2.3 反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：按照Trizol试剂盒步骤提取各组总的RNA。先反转录反应合成cDNA第一链后再行PCR反应(β-actin为内参)，Paxillin(383 bp) mRNA引物序列为F：5’-TGAAACTGGAACCCTTGTCC-3’，R：5’ TATGCTGGCA TTGTCTGGAG-3’；FAK(498 bp) mRNA引物序列为F：5’-TCCTAATGTTGATGCCTGCC-3’，R:5’-CCTTGAAAAGGCTTCACACC-3；MMP-2 (607 bp) mRNA引物序列为F：5’-ATCCAGACTTCCTC AGGCG-3’，R：5’-GTAGTTGGCCACATCTGGGT-3’；β-actin(170 bp) mRNA引物序列为，F：5’AAATCTGGCACCACACCTT-3’，R：5’-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3’。按照RT-PCR试剂盒说明逐步操作，PCR反应条件和步骤：96 ℃预变性6 min；96 ℃ 35 s，退火条件Paxillin (58 ℃、50 s)、FAK (58 ℃、48 s)、MMP-2 (60 ℃、 48 s)，三个基因在74 ℃延伸1.5 min，30个循环。取10 μl产物在1%琼脂糖凝胶电泳成像后分析其条带峰面积来反映Paxillin、FAK、MMP-2 中RNA表达的改变。

1.2.4 蛋白免疫印迹(Western blotting)：收集提取各组细胞总蛋白量，用Bradford 法测定蛋白质浓度后，取50 μg蛋白上样量，通过8%、12% SDS-PAGE电泳分离蛋白样本，再转至PVDF膜上，脱脂奶粉封闭后加入兔抗人Paxillin抗体(1∶300)、FAK抗体(1∶300)、MMP-2 抗体(1∶200)，放置4 ℃湿盒内孵育过夜；隔日先用TBS洗膜(10 min×3次)，再加入羊抗兔二抗，继续室温微摇2 h，再次TBS洗膜(10 min×3次)；X线胶片曝光显影，β-actin抗体作为内参上样对照，采用Gel-Doc图像分析系统测定各条带灰度值，反映Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表达变化。

1.2.5 侵袭小室(Boyden chamber)实验：脑胶质瘤U251细胞迁移、侵袭能力检测采用Boyden chamber小室观察分析。具体步骤如下：将各组细胞(每组大约105个细胞)悬浮在有0.2%的小牛血清的600 μl的培养液中，依次接种在Boyden小室的上层，培养6 h后收集迁移至滤膜下层的细胞，先用4%多聚甲醛固定后再用0.1%结晶紫染色(细胞“贴壁”面朝上，盖载玻片)，放置显微镜下随机计数滤膜下层的细胞个数，至少选取5个高倍(×400)视野内的穿膜细胞数，计算平均值。

2 结 果

2.1 各组细胞增殖抑制率比较 见表1。脑胶质瘤U251细胞在不同浓度的阿霉素作用24、48、72 h后，各组细胞增殖抑制率对比差异有统计学意义(均P<0.05)，相关分析发现在阿霉素浓度0～2.00 ng/ml的范围，脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率与其浓度无明显相关性(r=0.227,P>0.05)。单用阿霉素干预脑胶质瘤U251细胞24、48、72 h，IC50> 2.00 ng/ml，提示脑胶质瘤U251细胞对阿霉素作用不敏感。故采用2.00 ng/ml阿霉素完成后续实验；不同浓度的华蟾素干预脑胶质瘤U251细胞24、48、72 h后，各组增殖率比较差异有统计学意义(均P<0.05)，相关分析显示华蟾素浓度在0～25.00 μg/ml范围，脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率与华蟾素浓度关系呈负相关(r=-0.735，P<0.05)，提示脑胶质瘤U251细胞对华蟾素作用敏感，故选用10.00 μg/ml 华蟾素完成后续实验；联合组与其他各组比较，细胞增殖抑制率明显加强且表现一定的剂量依赖性。

表1 四组干预不同时间脑胶质瘤U251细胞增殖抑制率比较(%)

2.2 不同干预下脑胶质瘤U251细胞形态变化差异 见图1。未干预的脑胶质瘤U251细胞光镜下呈多边形、少圆形、梭形状贴壁生长，细胞膜边缘光整，细胞间排列结构紧密，易有核分裂，偶见坏死细胞，整个细胞多以弥漫均匀单层排列状。而加入华蟾素组、阿霉素组、联合组的细胞显示：少数细胞胞膜皱缩，细胞变圆，间隙变宽，且单个细胞体积变小，形态狭长，细胞连接松散，核分裂和坏死细胞增多，整体细胞数量减少，以联合组的效果最明显，药物组与对照组比较，细胞的生长活力均显示不同程度地被抑制。

2.3 不同干预下脑胶质瘤U251细胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表达情况 见表2。选取2.00 ng/ml阿霉素与10.00 μg/ml 华蟾素联合作用，结果显示与对照组相比，阿霉素组、华蟾素组、联合组Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表达量均显著减少(均P<0.05)。联合组与阿霉素组、华蟾素组的Paxillin、FAK、MMP-2表达量比较，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

表2 不同干预下脑胶质瘤U251细胞Paxillin、FAK、MMP-2 mRNA表达

2.4 不同干预下脑胶质瘤U251细胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表达情况 见表3。选取2.00 ng/ml阿霉素与10.00 μg/ml 华蟾素联合作用，结果显示对照组相比，阿霉素组、华蟾素组、联合组Paxillin、FAK、MMP-2蛋白的表达量均显著减少(均P<0.05)。联合组与阿霉素组、华蟾素组的Paxillin、FAK、MMP-2表达量比较，差异具有统计学意义(均P<0.05)。

A:对照组;B:2.00 ng/ml 阿霉素组;C:10.00 μg/ml 华蟾素组;D:2.00 ng/ml 阿霉素+10.00 μg/ml华蟾素组

表3 不同干预下脑胶质瘤U251细胞Paxillin、FAK、MMP-2 蛋白表达

2.5 不同干预下脑胶质瘤U251细胞侵袭能力差异 见表4(图2)。各组作用48 h后，收取各组细胞，接种在小室的上层。选取2.00 ng/ml阿霉素与10.00 μg/ml华蟾素联合作用，结果显示与对照组比较，华蟾素组、阿霉素组及联合组穿模细胞数均下降，联合组的细胞的穿膜数下降最明显(均P<0.05)，华蟾素组与阿霉素组相对比较显示无统计学意义(P>0.05)。Boyden chamber结果提示，联合组可以显著抑制脑胶质瘤U251细胞的侵袭、迁移能力。

表4 不同干预下脑胶质瘤U251细胞的侵袭能力(%)

A:对照组;B:2.00 ng/ml 阿霉素组;C:10.00 μg/ml华蟾素组;D:2.00 g/ml阿霉素+10.00 μg/ml华蟾素组

3 讨 论

最新发布的中国恶性肿瘤流行病学数据显示，恶性肿瘤的发病率逐年增长，严重危害人类健康和生活。目前，晚期恶性肿瘤的治疗仍以手术治疗为主，术后化学治疗为辅，而化疗药物自身的不良反应，导致临床治疗效果不尽人意，且严重影响患者术后生活质量。前期实验中我们发现华蟾素可以抑制肿瘤细胞，提升患者免疫功能，且与阿霉素联合可通过提高脑胶质瘤U251细胞p21WAF1、p27、Bax蛋白的表达，来增强脑胶质瘤U251细胞的凋亡，提高阿霉素的疗效[9-10]。阿霉素作为化疗药物在临床治疗中会产生不良反应，但研究已经证实，合理恰当的浓度具有抗肿瘤功效。华蟾素因其能抑制肿瘤细胞生长、鲜有不良反应已被临床认可且推荐应用。四甲基偶氮唑蓝比色法(MTT)结果证实华蟾素和阿霉素具有交互作用，阿霉素可以抑制脑胶质瘤U251细胞的增殖但效果不明显，阿霉素与华蟾素联合作用脑胶质瘤U251细胞，对其增殖抑制作用优于各单药作用组，且与药物浓度、干预时间呈现正相关性。前期实验也证实了华蟾素与低剂量阿霉素联合作用不仅提高阿霉素对脑胶质瘤U251细胞的敏感性且降低了阿霉素自身的不良反应。阿霉素单药作用对脑胶质瘤U251细胞的增殖抑制效应明显弱于华蟾素单药组。药理机制可能是阿霉素对脑胶质瘤U251细胞灵敏度低于华蟾素，因此本实验为了增加阿霉素的敏感度同时减弱其不良反应，并且保持其现有的实验效应，我们选用将阿霉素与华蟾素联合，发现其作用效应仍强于各单药作用，推测阿霉素联合华蟾素对脑胶质瘤U251细胞的作用可能是通过调控某些相关的基因表达来发挥效应。Paxillin基因定位在人染色体12q24，是LIM家族蛋白成员，分布在黏着斑，更是重要的细胞黏附因子之一。它能够与整合素关联，可与BCR-AB2、v-Src、v-Crk等致瘤性蛋白结合，促使致瘤性酪氨酸激酶活化，是构成细胞与细胞外基质局部黏附的关键通路。Paxillin能调节细胞移动、散播，扰乱或误导控制细胞增殖所需的生长因子信号级联的传递，改变肿瘤细胞运动黏附的信号传导，进而提高肿瘤细胞转移、侵袭的能力[11-14]。目前许多研究[7，15]已证实，肺癌、肝癌、乳腺癌等肿瘤中Paxillin呈高表达，且高表达的Paxillin加强了肿瘤细胞与周围非肿瘤细胞之间的局部黏附作用，使肿瘤细胞更易发生浸润、迁移进而形成转移。我们在前期实验中发现脑胶质细胞瘤中也存在Paxillin基因的高表达,且Paxillin的表达水平与脑胶质细胞瘤的分化程度、淋巴结转移及侵袭性呈正相关。故本课题采用华蟾素联合阿霉素作用脑胶质瘤U251细胞，研究能否对细胞黏附相关蛋白FAK和与侵袭转移有关的基因MMP-2表达产生作用进而影响Paxillin基因的表达来影响脑胶质瘤U251细胞的侵袭转移。基质金属蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMPs)是细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)的重要蛋白水解酶，是降解人体内细胞外基质的主要酶类，对于肿瘤细胞转移突破物理屏障及促使肿瘤克隆增殖，加促新生血管的形成有重要意义[16-19]。MMPs是FAK信号传导通路的下游分子，因其几乎能降解细胞外基质的所有成分而备受研究者青睐[20-21]。在本实验中，我们首先将脑胶质瘤U251细胞株消化处理成3×104/ml的悬液，分为四组。阿霉素组分别加入0.10、0.25、0.50、1.00、2.00 ng/ml的阿霉素；华蟾素组依次滴加5.00、10.00、15.00、20.00、25.00 μg/ml浓度的华蟾素；联合用药组加入0.10、0.50、2.00 ng/ml的阿霉素和华蟾素 10.00 μg/ml；对照组替代加入同剂量RPMI-1640培养液。分别培养24、48、72 h。四甲基偶氮唑蓝比色法检测各组对脑胶质瘤U251细胞增殖抑制的影响；并从中选出最优联合浓度进行探讨；RT-PCR和Western blotting方法检测在不同干预条件下细胞中Paxillin、FAK、MMP-2基因和蛋白的表达。结果显示，与对照组相比，华蟾素组、阿霉素组、华蟾素和阿霉素联合组干预脑胶质瘤U251细胞后，其Paxillin、FAK、MMP-2在mRNA表达水平和蛋白表达水平均明显下降，华蟾素和阿霉素联合组下降更显著，提示Paxillin表达的下降能引起FAK、MMP-2表达的相应下降，其机制可能是因为MMP-2是FAK信号的下游靶基因，FAK表达水平的高低会直接影响MMP-2的表达，但三者之间是通过何种信号通路传递？如何彼此相互作用、相互影响是我们需要继续深入研究的方向。华蟾素和阿霉素联合组可以显著下调Paxillin基因的表达，进而相应引起FAK、MMP-2 mRNA和蛋白水平的降低，那么Paxillin表达水平的降低是否会引起脑胶质瘤U251细胞相应生物学行为发生改变呢？Boyden chamber小室体外侵袭实验检测华蟾素、阿霉素、华蟾素联合阿霉素对脑胶质瘤U251细胞侵袭、迁移能力的变化，结果显示：与对照组相比，华蟾素、阿霉素单药组、联合组均可以引起穿膜细胞数明显减少，联合组穿膜细胞数减少更显著，Paxillin基因表达的下降可能引起脑胶质瘤U251细胞迁移能力的减弱，更进一步验证华蟾素和阿霉素联合具有可行性，两者联用通过抑制Paxillin基因的表达来阻止肿瘤细胞发生转移增强抗肿瘤的作用。华蟾素不仅可以直接杀伤肿瘤细胞和减弱肿瘤侵袭力，还可联合阿霉素产生协同效应，加强阿霉素对肿瘤细胞的敏感度，是较理想的化疗药物增效剂和保护剂。然而，为什么Paxillin基因表达的降低可以减弱肿瘤细胞的迁移能力，一方面这与FAK、MMP-2表达降低直接相关，还有无其它具体机制尚需进一步深入研究和探讨。