膀胱尿路上皮癌组织中ERG蛋白表达水平与微血管密度和肿瘤分期相关性研究

王 磊，白玉勤

(1.锦州医科大学，辽宁 锦州 121001；2.赤峰市医院肿瘤内一科，内蒙古 赤峰 024099；3.赤峰市肿瘤医院病理科，内蒙古 赤峰 024099)

膀胱尿路上皮癌(Bladder transition cell carcinoma，BTCC)是泌尿科常见的恶性肿瘤，与吸烟、化学品接触史等因素有关，早期临床表现为排尿困难、无痛性间歇肉眼血尿，可伴有膀胱刺激症状等，因其早期症状常为间歇发作，少有人关注，入院诊疗时多为恶性转移，生存率较低[1-2]。肿瘤细胞的生长、繁殖及扩散等生理活动与其外周血管的生成有着极大的联系，近年来，有不少学者认为抑制肿瘤血管的生长有利于控制肿瘤的生理活动，从而延缓肿瘤患者的生命[3-4]。内皮细胞的分化是血管生成的重要机制[5]，ERG是ETS家族的一员，在血管内皮细胞中广泛表达，属于内皮细胞分化的标志物[6]。EGR的表达在血管源性肿瘤以及前列腺癌中呈高表达状态，在临床已引起关注，但在BTCC中的关注较少[7]。微血管密度(Microvessel density，MVD)是临床公认可评估肿瘤细胞血管生成程度的指标[8]。因此，本研究检测了BTCC组织中的EGR蛋白以及MVD表达水平，并与其癌旁组织做对比，分析BTCC中ERG蛋白表达水平与MVD和肿瘤分期的相关性，旨在为临床诊疗BTCC提供新方向。

1 对象与方法

1.1 研究对象 本研究经本院伦理委员会审核并通过，取得患者及其家属知情同意，选取2019年3月至2021年3月于本院确诊的62例BTCC患者的癌组织及癌旁组织石蜡标本，标本均为我院病理科存档标本，病例纳入标准：经临床确诊为BTCC。排除标准：病理及临床资料缺损者。其中男46例，女16例，年龄42～68岁，平均(54.96±6.02)岁。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集：自制信息调查表，通过查阅病历的方式整理入组患者的临床相关资料：性别、病理类型、肿瘤分期、数目等。

1.2.2 切片染色：将石蜡包埋组织切片，厚度为5 μm，进行常规脱蜡处理(二甲苯溶液，5 min)后在常温下用梯度酒精进行脱苯和水化，使用苏木素进行染色(2 min)后进行清洗，采用1%盐酸酒精进行浸泡(1 min)，清洗后使用伊红染色处理(3～5 min)，清洗后再次进行梯度酒精脱水处理，待染色成功后行盖玻片封层固定，在光镜下进行切片观察。

1.2.3 ERG、PD-L1表达水平检测：人ERG以及程序性死亡受体配体1(Programmed cell death-ligand 1，PD-L1)多克隆抗体试剂采自武汉益普生物科技有限公司。免疫组化采用Envision法，采用3% H2O2对切片内源性生物酶素进行灭活后进行高温高压抗原修复(修复液：柠檬酸盐缓冲液)，滴入一抗，在4 ℃的条件下进行过夜培育后清洗进行二抗缓慢滴入，在37 ℃的条件下进行30 min培育，采用DAB显色处理后进行苏木素复染，再次脱水，完成后进行切片封闭，在光镜下进行切片观察。阴性对照一抗采用磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution，PBS)，阳性对照为自身对照，与同一切片检验目的物对照。

1.2.4 MVD计数：在100倍光镜下寻找切片中MVD最密处，调高光镜倍速至200倍，在选定的视野中进行MVD计数。一张切片选定3个视野，以最终平均数作为评估数据。

1.2.5 结果判读：由2名资深检验技师同时进行结果判读，在有歧义时邀请另一名资深技师参与结果的判断，共同谈论明确结果。PD-L1表达于细胞膜，EGR表达于细胞核。PD-L1蛋白表达≥1%为阳性，反之为阴性。EGR蛋白表达参照Axiotis病理评分标准[9]，以染色强度和对应的阳性细胞数量进行评估，阳性细胞为棕褐色。染色强度：0分，无染色；1分，浅黄色；2分，棕黄色，3分，黄褐色。阳性率=阳性表达细胞数/视野总细胞数×100%。0分，无表达；1分，>25%；2分，25%～50%；3分，>50%。评估标准：染色强度评分+阳性率评分。0分为阴性，反之均为阳性；1～3分为阳性低表达；4～6分为阳性高表达。

1.3 观察指标 记录各指标的表达水平，分析各指标阳性表达情况与临床特征的关系，以及ERG、PD-L1蛋白与MVD的相关性。

2 结 果

2.1 BTCC癌组织和癌旁组织中ERG、PD-L1蛋白阳性表达情况比较 BTCC癌组织中ERG阳性表达39例(62.90%)，明显高于癌旁组织中的ERG阳性表达12例(23.08%)(P<0.001)；BTCC癌组织中PD-L1阳性表达26例(41.94%)，明显高于癌旁组织中的PD-L1阳性表达5例(8.06%)(P<0.01)。见表1。

表1 BTCC癌组织和癌旁组织中ERG、PD-L1蛋白阳性表达情况比较[例(%)]

2.2 BTCC癌组织和癌旁组织中MVD表达水平比较 BTCC癌组织的MVD水平明显高于BTCC癌旁组织(P<0.001)，见表2。

表2 BTCC癌组织和癌旁组织中MVD表达水平比较

2.3 不同临床特征BTCC癌组织中ERG、PD-L1蛋白表达情况 ERG与PD-L1蛋白阳性表达率在病理类型、肿瘤分期、肿瘤数目中存在统计学差异，在浸润性癌、肿瘤高分期、多发性肿瘤中阳性表达率增高(均P<0.05)，见表3。

表3 不同临床特征BTCC癌组织中ERG、PD-L1蛋白表达[例(%)]

2.4 不同临床特征BTCC癌组织中 MVD表达水平比较 MVD水平表达在病理类型、肿瘤分期、肿瘤数目中存在统计学差异，在浸润性癌、肿瘤高分期、多发性肿瘤中水平增高(均P<0.05)，见表4。

表4 不同临床特征BTCC癌组织中MVD表达水平比较(个/mm2)

2.5 ERG、PD-L1蛋白表达与MVD相关性分析 以ERG、PD-L1蛋白表达水平为自变量，MVD为因变量，Pearson相关性结果显示ERG、PD-L1蛋白表达与MVD水平均呈正相关(r=0.426，0.357，P<0.05)。以ERG为自变量，PD-L1为因变量，Pearson相关性结果显示ERG蛋白表达与PD-L1呈正相关(r=0.512，P<0.05)。

3 讨 论

膀胱癌是临床泌尿系统肿瘤最常见的恶性肿瘤之一，其病死率在所有泌尿系统恶性肿瘤中处于第一位，尿路上皮癌是膀胱癌中最多见的一种，占比高达90%。 BCTT具有多发性、复发性、扩散性高等特点，因而如何控制其复发、扩散，以改善患者预后是临床常考虑的重点课题。目前临床常根据患者的肿瘤组织分期来进行对应治疗，但传统的病理组织学检测对于预判病情的发展和恶化存在缺陷。近年来，随着分子生物学的不断发展，在肿瘤组织发展和恶化的生物过程中也寻找了一些具有标志性的蛋白因子，如纤维蛋白原、膀胱肿瘤抗原等，具有较高的敏感性，在预判肿瘤组织的发展和恶化中具有一定的价值，但其特异性较低，存在误诊的现象[10]。因而寻找一类敏感性和特异性均较高的标志物对BCTT患者的临床诊疗具有重要意义。

在查找相关文献过程中，笔者发现有诸多研究表示血管内生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在肿瘤细胞生长、增殖和发展中有着重要地位。VEGF可促进肿瘤外周血管的新生，为肿瘤细胞的生长提供了有利的条件，其水平的变化可反映肿瘤细胞的生长状态，可为预判患者病情的走向及预后提供有利证据[11]。MVD是评估血管活性的指标，与VEGF的水平变化具有密切关系[12-13]。研究显示，BTCC癌组织细胞中的MVD水平明显高于BTCC癌旁组织，提示BTCC癌组织的血管相对丰富。ERG是ETS家族中的一员，既往研究[14]显示，其在前列腺癌细胞中的表达异常，在正常腺体中未见异常表达状态，因而认为ERG蛋白表达在前列腺癌患者中具有重要意义。曹丽娟等[15]研究显示在血管瘤中也有阳性表达，提示ERG蛋白表达可能在肿瘤细胞中具有特异性表达。本研究显示，ERG蛋白在BTCC癌组织中的阳性表达率明显高于癌旁组织，说明ERG蛋白的异常表达可诊断BTCC。ERG蛋白表达于血管内皮细胞核中，且本研究显示，ERG蛋白表达与MVD水平具有相关性，说明ERG蛋白表达可能有促进肿瘤血管的生成的作用。

本研究显示，PD-L1在BTCC癌细胞的阳性表达率高于癌旁组织，说明PD-L1在癌组织中呈高表达状态。免疫系统是阻止病菌侵入和发展的第一道防线，但一旦发生肿瘤，肿瘤释放的一类因子可阻断免疫系统的正常生理过程，程序性死亡受体1(Program cell death 1，PD-1)是人体免疫抑制分子，在细胞的分化和调亡中发挥着作用[16]。樊剑等[17]研究显示，以PD-1作为靶点，进行抗肿瘤和抗自身免疫性疾病中具有重要意义。PD-L1蛋白是PD-1的配体，有报道[18-19]称，肿瘤细胞中均有PD-L1蛋白的表达，其表达水平的升高可诱导抗肿瘤T细胞调亡，为肿瘤细胞的生长和发展提供能量，促进其恶化。本研究显示，ERG与PD-L1蛋白表达呈正相关，PD-L1与MVD呈正相关，提示ERG与PD-L1在肿瘤细胞的生理过程存在协同关系，PD-L1可能对肿瘤血管的形成有影响。研究显示，ERG、PD-L1蛋白阳性表达率、MVD水平在浸润性癌、肿瘤高分期、多发性肿瘤中阳性表达率和表达水平增高，与吴林林等[20]研究部分一致，说明ERG、PD-L1和MVD均参与着肿瘤细胞的调节和发展。

综上所述，ERG蛋白在BTCC癌细胞中存在特异性表现，可能与PD-L1蛋白、MVD共同参与肿瘤血管的生成和恶性进展，临床可联合ERG、PD-L1和MVD评估患者预后。本研究未探讨ERG蛋白参与肿瘤发展的机制，今后应扩大样本量，进行深入研究。