基于UPLC-Q-TOF-MS/MS的裸花紫珠水提物化学成分分析

徐萌伶，王云云，郁 萌，侯文成，刘洋洋

中国医学科学院&北京协和医学院 药用植物研究所海南分所 海南省南药资源保护与开发重点实验室，海口 570311

裸花紫珠药材为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook. et Arn)的干燥叶，又名赶风柴、节节红等，药用历史悠久，具有消炎，解肿毒，化湿浊，止血等功效，主治细菌性感染引起炎症肿毒，急性传染性肝炎，外伤出血等症[1,2]，收载于《中国药典》 2020年版一部。裸花紫珠主要分布于我国广东和海南以及马来西亚等地，为海南道地药材，海南黎族民间常以水煎煮液治疗细菌感染引起的炎症、急性传染性肝炎、呼吸道和消化道出血等症。

裸花紫珠的主要成分为黄酮类[2]、苯乙醇苷类[3]、环烯醚萜类[4]等。由于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术集UPLC高效的分离能力、检测灵敏度高和质谱丰富的结构信息采集优势为一体，可以快速高效鉴定天然药物中的化合物，能有效避免复杂的中药提取物样品仅依靠保留时间定性而可靠性差的问题[5]。Li等[6]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS从裸花紫珠不同溶剂提取物中鉴定出17个化合物[6]；Yi等[7]采用UPLC-Q-TOF-MS/MS分析比较了裸花紫珠的绿叶、黄叶、枝条、种子不同部位的化学成分。已有研究主要集中于对裸花紫珠乙醇提取物进行分析，然而裸花紫珠在黎族民间常以水煎煮后服用，提示裸花紫珠水溶性成分中可能含有诸多生物活性成分。因此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对裸花紫珠药材水提物的化学成分进行分析鉴定，为裸花紫珠药材水提物的化学成分及其后续的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验仪器与试剂

超高效液相色谱质谱联用仪：主要包括Acquity UPLC®I-Class系统，Xevo G2-XS Q-TOF质谱系统，自动进样器，二元溶剂管理器(Waters公司，美国)；ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm×50 mm，2.2 μm)色谱柱(Waters公司，美国)；PL203千分之一电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；R-210旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司)。

甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)；甲酸(质谱级，美国霍尼韦尔)；乙腈(质谱级，美国Fisher公司)；实验用水(Mili-Q超纯水)；裸花紫珠干燥叶(批号J001190702)由海南九芝堂药业有限公司提供，经中国医学科学院药用植物研究所海南分所李榕涛鉴定为马鞭草科紫珠属植物裸花紫珠(CallicarpanudifloraHook. et Arn)的干燥叶。

1.2 供试品溶液的配制

取自然风干的裸花紫珠叶，粉碎，过4号筛。精密称取5 g药材粉末，加水75 mL，加热回流2 h，过滤，浓缩至干。取浸膏约0.1 g，精密称定，加10%甲醇水溶液溶解，并定容至50 mL，即得供试品溶液。

1.3 UPLC-Q-TOF-MS检测条件

1.3.1 色谱条件

采用ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm× 50 mm，2.2 μm)色谱柱，流速0.25 mL/min，进样量5 μL，柱温30 ℃；流动相为0.1%甲酸溶液(A)-乙腈溶液(B)，梯度洗脱：0～6 min，8%→15%A；6～16 min，15%→25%A。

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源ESI，采用正负离子模式两种扫描方式，扫描范围为m/z50～1 500，扫描时间为1.5 s，检测时间16 min，低能量碰撞电压6 V，高能量碰撞电压20～60 V，雾化气和干燥气均为氮气。

2 结果与分析

采用“1.3.1”与“1.3.2”项下的色谱和质谱条件，对供试品溶液进样分析，得到正、负离子模式下的总离子流图(total ions current，TIC)，通过比较正负离子模式下主要化合物的质荷比，分离度、响应等因素后，选用负离子模式下总离子流图响应较高。因此，选用负离子模式下的总离子流图(TIC)进行成分解析。首先根据国内外裸花紫珠相关文献，收集裸花紫珠中的化学成分，自行建立数据库，与质谱中得到的准分子离子、特征碎片离子进行比对。其次，根据裸花紫珠水提物在负离子模式下的总离子流图获得的准分子离子峰所提供的化合物相对分子质量信息，选择目标离子扫描进行二级质谱研究，得到化合物的特征碎片离子信息，进而对裸花紫珠水提物分离出的主要峰进行分析，推测其可能存在的裂解方式，共得到37个可能的化合物。裸花紫珠水提物在正负离子模式下的总离子流图见图1及图2，鉴定出化合物的名称、准确分子离子信息见表1。

图1 裸花紫珠水提物供试品负离子模式TIC图Fig.1 Negative ion mode TIC of the aqueous extract from raw C.nudiflora

图2 裸花紫珠水提物供试品正离子模式TIC图Fig.2 Positive ion mode TIC of the aqueous extract from raw C.nudiflora

表1 裸花紫珠水提物中化学成分鉴定结果

续表1(Continued Tab.1)

2.1 裸花紫珠水提物中的苯乙醇苷类化合物

裸花紫珠水提物中主要成分是苯乙醇苷类化合物，在负离子模式下，以[M-H]-的形式存在。苯乙醇苷类是以β-葡萄糖为母核，由苯乙醇和苯丙烯酸通过酯键或糖苷键连接形成的天然糖苷类化合物，苯乙醇典型碎片为m/z153，苯丙烯酸主要以咖啡酸为主，其典型的裂解碎片m/z179和m/z161。另外，葡萄糖上还会有鼠李糖基、芹菜基等取代，形成多糖苷。根据文献参考，以其代表性成分毛蕊花糖苷和连翘脂苷为例，峰26毛蕊花糖苷在负离子模式下经一级质谱扫描得到其准分子离子m/z623.199 8 [M-H]-(见图3)，脱去咖啡酰基得到m/z461.163 8的碎片离子，脱去葡萄糖基、鼠李糖基和phA得到咖啡酸碎片m/z179，进而脱去1分子水得到161.021 0的碎片离子峰，与文献[8]对应一致，因此鉴定该成分为毛蕊花糖苷。

图3 毛蕊花糖苷二级质谱Fig.3 Product ion spectrum of acteoside

峰2的分子式为C20H30O12，保留时间为1.406 min，准分子离子峰m/z461.163 8 [M-H]-，表明其极性较大，二级质谱图见图4，m/z461的准分子离子峰发生中性丢失鼠李糖基的裂解反应，得到m/z315的碎片离子，这是二羟基苯乙醇苷的母核碎片离子，该离子继续裂解，丢失1分子葡萄糖和水m/z180，产生m/z135的碎片离子。由裂解途径可知该化合物其中含有鼠李糖基和二羟基苯乙醇苷，与文献[9]比对后，因此鉴定为连翘脂苷E。

图4 连翘脂苷E二级质谱Fig.4 Product ion spectrum of forsythoside E

峰23的准分子离子峰为m/z755.238 0(见图5)，分子式为C34H44O19，可见丢失咖啡酰基m/z162后产生m/z593 的碎片离子，继续发生裂解反应，丢失鼠李糖基后产生m/z447的碎片离子和丢失芹菜基后产生的m/z461的碎片离子，丢失葡萄糖基后产生m/z285的碎片离子，后可见m/z161和m/z179的咖啡酰基的典型裂解碎片，比化合物连翘脂苷E多了一分子的芹菜基和一分子咖啡酰基，通过与文献[10,11]数据比对，鉴定该化合物为连翘脂苷B。

图5 连翘脂苷B二级质谱Fig.5 Product ion spectrum of forsythoside B

2.2 裸花紫珠水提物中的黄酮类化合物

黄酮类化合物是裸花紫珠中的另一主要化合物，木犀草素是其基本母核。研究表明，黄酮类化合物均发生系列以C环为中心的断裂、丢失与重排反应黄酮类化合物，易丢失H2O、CO2等碎片离子[12]。在负离子模式下，以[M-H]-的形式存在。

峰14的分子式为C29H34O15，在化合物12的基础上增加了两个二甲氧基，在二级质谱中可见丢失Glc之后的m/z475 [M-H-Glc]-的碎片离子(见图6)，以及木犀草素典型碎片离子m/z285。经过与文献[13,14]比对，鉴定该化合物为3′,4′-二甲氧基木犀草素-7-O-新橙皮苷。

图6 3′,4′-二甲氧基木犀草素-7-O-新橙皮苷二级质谱Fig.6 Product ion spectrum of 3′,4′-dimethoxyluteolin-7-O-neohesperidoside

峰16在负离子模式下经一级质谱扫描得到准分子离子峰为m/z463.087 9 [M-H]-(见图7)，在二级质谱中脱去1分子Glu之后得到m/z301的碎片离子，及木犀草素典型碎片离子m/z285，根据文献[15]比对，鉴定该化合物为6-羟基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷。

图7 6-羟基木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷二级质谱Fig.7 Product ion spectrum of 6-hydroxyluteolin 7-O-β-D-glucoside

峰22的分子式为C21H20O11，准分子离子峰为m/z447.092 9(见图8)，在二级质谱中可见其加合离子m/z523.144 3 [M+HCOOH-H]-，丢失Glu后剩余的典型m/z285木犀草素的苷元碎片离子，以及木犀草素发生黄酮类经典RDA裂解产生的m/z133碎片离子，通过比对文献[16]数据，鉴定该化合物为木犀草苷。

图8 木犀草苷二级质谱Fig.8 Product ion spectrum of cynaroside

2.3 裸花紫珠水提物中的环烯醚萜类化合物

环烯醚萜类化合物是裸花紫珠的另一化合物，目前对该类化合物的研究发现，其主要集中在以梓醇为母核，连接以咖啡酰、香豆酰和阿魏酰等形成衍生物。在负离子模式下，易失去中性H2O、CO2、CH3OH等形成[M-H]-。

峰9在负离子模式下形成准分子离子峰m/z523.144 3 [M-H]-(见图9)，二级质谱下可见m/z361的碎片离子，在母离子m/z523.144 3的基础上减少了m/z162，说明是在母离子的基础上丢失了1分子的葡萄糖苷形成的梓醇的典型碎片，同时还观察到m/z179和m/z161的咖啡酸典型碎片，通过与相关文献[5,17]比对，鉴定该化合物是6′-O-咖啡酰梓醇。

图9 6′-O-咖啡酰梓醇二级质谱Fig.9 Product ion spectrum of 6′-O- caffeoylcatalpol

峰20在负离子模式下形成准分子离子峰m/z537.159 2 [M-H]-(见图10)，二级质谱下可见阿魏酸m/z193和阿魏酰m/z175的关键碎片离子，以及代表梓醇的m/z361碎片离子，通过与相关文献[5,17]比对，鉴定该化合物是6-O-阿魏酰梓醇。

图10 6-O-阿魏酰梓醇二级质谱Fig.10 Product ion spectrum of 6-O-feruloylcatalpol

峰34在负离子模式下形成准分子离子峰m/z521.164 7 [M-H]-(见图11)，二级质谱下可见m/z297、m/z195和m/z163的关键碎片离子，通过与相关文献[18]比对，鉴定该化合物是6-O-香豆酰-8-表番木鳖酸。

图11 6-O-香豆酰-8-表番木鳖酸二级质谱Fig.11 Product ion spectrum of 6-O-coumaroyl-8-epi-loganic acid

3 讨论与结论

本研究从裸花紫珠水提物中共鉴定出37个化学成分，包括毛蕊花糖苷、异毛蕊花糖苷和连翘酯苷B等16个苯乙醇苷类化合物，木犀草苷等5个黄酮类化合物和16个环烯醚萜类化合物。而Li等[6]从裸花紫珠水提物中仅鉴定出15个化合物。此外，本研究首次从裸花紫珠中发现并鉴定出京尼平苷酸、连翘脂苷E和肉苁蓉苷F等3个化合物。

裸花紫珠水煎液在民间常用于治疗细菌感染引起的炎症、急性传染性肝炎、呼吸道和消化道出血等症，国内外学者从现代化学与药理研究角度已有报道。Guan等[19]发现木犀草苷具有较强的杀菌消炎、解热镇痛的功效，表现出良好的抗病毒和抗肿瘤作用；Jiang等[20]发现连翘酯苷B具有抗炎、抗氧化作用，从而改善心肌缺血-再灌注(I/R)模型造成的大鼠心脏功能损伤；Zhang等[21]发现毛蕊花糖苷可显著缩短活化部分凝血活酶时间(APTT)，通过影响内源性凝血途径发挥止血作用；Nam和Chae等[22,23]发现异毛蕊花糖苷具有显著的抗炎活性和抗氧化活性，而Tang等[24]则发现毛蕊花糖苷和异毛蕊花糖苷均可促进小鼠骨髓来源树突状细胞的增殖，表现出一定的神经保护作用。可见，木犀草苷、毛蕊花糖和异毛蕊花糖苷的生物活性与裸花紫珠传统功效相关，其实毛蕊花糖苷和连翘酯苷B等化合物也常作为含量测定指标用于评价裸花紫珠质量优劣[25]。因此，木犀草苷、毛蕊花糖和异毛蕊花糖苷可作为裸花紫珠指标性成分。

本文采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术对裸花紫珠水提物中的化学成分进行鉴定，并结合其药理活性，推测了裸花紫珠的指标性成分，可为裸花紫珠后续药效物质基础研究及中成药二次开发和质量控制提供参考。