单核苷酸多态性和免疫细胞在糖尿病肾脏疾病中的研究进展

郭梦然，闵 行，叶 月，许晓双，甄东户

(1.兰州大学 第一临床医学院 内分泌科， 甘肃 兰州 730030； 2.兰州大学第一医院 内分泌科， 甘肃 兰州 730030)

近年来，中国糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease,DKD)的患病率不断上升，由2001年的34.7%到2017年的20%～40%[1]。仍然是终末期肾脏疾病(end stage renal disease,ESRD)最常见原因及死亡原因[2]。DKD的发病涉及糖脂代谢紊乱、氧化应激、血流动力学异常、炎性因子及遗传易感因素等。其中对遗传易感基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNPs)研究为预测DKD发病及进展提供新的思路，以便早期发现DKD高危人群, 对实现DKD早期预测和防治具有重要意义；再者，DKD又是一种炎性反应性疾病，最终导致结构重塑和肾脏纤维化， 其中免疫细胞的作用不可忽视，T细胞和2型固有淋巴细胞(type-2 innate lymphoid cell,ILC2)分泌细胞因子参与肾脏慢性炎性反应。这将进一步丰富DKD的病理生理机制。

1 遗传易感基因

在慢性疾病的发病中基因与环境交互作用，有助于解释人群易感性差异的原因，进而可以对环境与疾病、基因与疾病的关系有深入的认识，遗传因素可以通过影响肾脏对环境因素的反应性来增加DKD的易感性[3]。确定DKD的易感基因不仅有助于从分子水平认识其发病机制，同时还可能筛选出高危人群，以利于早期诊断及防治，甚至进行基因治疗。

1.1 吞噬和细胞运动性1基因(ELMO1)多态性与DKD的患病风险的关系

其位于7号染色体短臂1区4带(7p14)，编码一种可溶性细胞质蛋白，在哺乳动物细胞凋亡和细胞吞噬过程中介导细胞骨架重排。首次在日本T2DM患者中筛选出ELMO1基因，随后在肾小管和肾小球上皮细胞中检测到ELMO1编码蛋白的表达，在糖尿病小鼠的肾脏中该蛋白表达明显升高；并且ELMO1的过量表达导致细胞外基质(extracellular matrix,ECM)基因表达增加和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)基因表达减少[4]，提示持续过表达的ELMO1会使细胞外基质蛋白过度积累，挤压闭塞毛细血管、减少滤过面积，破坏肾脏细胞导致组织重塑，加速糖尿病性肾小球硬化的发生和发展。后来，在伊朗人群[5]、南印度人群[6]和中国汉族人群中ELMO1作为DKD易感基因的关键作用已得到验证。其中ELMO1rs741301是研究最多的风险位点：证实是伊朗人群DKD易感性的重要候选基因，同样在南印度人群与DKD显著相关；ELMO1rs741301与马来西亚人群[7]DKD的易感性无关，在美洲印第安人群中ELMO1rs1345365而非rs741301与DKD风险相关。在1 000人中国汉族的样本[8]中发现ELMO1rs741301-G等位基因和rs10255208-GG基因型与DKD风险增加相关；同时发现了显著的rs741301和饮酒之间的基因-环境相互作用组合：拥有rs741301-AG / GG基因型的饮酒者的DKD风险增加。尽管中国56个种族，但汉族人群基数大，仍具有代表性，这为进一步研究中国人群中其他风险位点和基因-环境相互作用提供了参考。

1.2 溶质载体家族12成员3/氯化钠共转运蛋白基因(solute carrier family 12 member 3,SLC12A3)与DKD及进展的关系

其在肾脏中特异性表达，编码噻嗪类敏感的Na-Cl协同转运蛋白(Na-Cl cotransporters,NCC)，是远曲小管吸收盐的关键转运蛋白[9]。全基因组关联分析(GWAS)中SLC12A3基因是DKD的易感基因。在人类中，SLC12A3是包含26个外显子的55 kb基因，编码的NCC具有1 002～1 028个氨基酸残基，其中第23个外显子Arg913Gln次要等位基因突变(密码子发生G→A的转换)，使得913位点的精氨酸(Arg)变为谷氨酰胺(Gln)[10]。G/ A在不同人群对DKD表现出不同的作用：日本人群中外显子23与DKD显著相关，突变体A与微量白蛋白尿的发展和(或)向大量白蛋白尿的进展呈负相关；而在韩国朝鲜族人群发现，突变体A与DKD发展进展呈正相关[11]。与韩国人或日本人的结果不同，SLC12A3基因的遗传变异与白种人T2DM患者的DKD敏感性没有显著相关性。显然，Arg913Gln变异对不同种族DKD发病机制的影响仍存在争议。调查中国T2DM患者SLC12A3中 Arg913Gln变异与ESRD风险之间的关系[12]，结果支持韩国人群的发现，而与日本人群相反：在对照组(未透析DKD)，GA + AA携带者的尿白蛋白排泄率(UAER)和舒张压明显高于GG携带者，推测A等位基因可能通过增加中国T2DM患者的UAER、升高血压来增加DKD风险；DKD-ESRD组(由T2DM引起的ESRD，接受血液透析)的GA + AA基因型频率显著高于对照组。这是首次在中国人群中的病例对照研究，使GA + AA基因型用于预测T2DM患者DKD-ESRD的发生和发展成为可能。

2 免疫细胞在DKD中扮演的角色

免疫过程与炎性反应相互调节，当两者不能及时终止时，即产生病理损害[13]。免疫调节在DKD的发生和发展中所起的重要作用现在是无可争议的。这种调节包括增加免疫细胞向肾脏的聚集、促炎性细胞因子和趋化因子的产生、免疫复合物的形成以及补体的活化[14]。许多研究证实肾脏慢性炎性反应过程中T细胞及细胞因子过度募集，同时一类可以分泌细胞因子的固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)逐渐走入研究者的视线。

2.1 T淋巴细胞通过慢性炎性反应途径促进DKD发生

T细胞主要分为CD4和CD8亚群，CD4细胞又根据分泌细胞因子及功能不同分为辅助性T细胞(T-helper Th1、Th2、Th17等)、调节性T细胞(T-regulatory,Treg)。DKD患者高糖状态下招募单核细胞和T淋巴细胞到肾组织，与肾实质细胞相互作用分泌一系列促炎因子引发肾组织的慢性炎性反应和肾间质纤维化[15]，诱导肾肥大和超滤，从而加速DKD的病程(图1)。CD8细胞与胰岛素抵抗：在高脂饮食的小鼠中，观察到CD8细胞的浸润现象先于巨噬细胞积累，一旦使用特异性抗体耗尽了CD8 细胞，则巨噬细胞浸润、脂肪组织炎性反应和全身胰岛素抵抗得到改善；还发现脂肪组织激活CD8细胞，然后促进该组织中巨噬细胞的募集和激活。这提示CD8 细胞在脂肪组织炎性反应和全身性胰岛素抵抗的引发和维持中起着重要作用[16]。CD4细胞亚型在DKD中的作用: 研究发现与非DKD患者相比，DKD患者血清Th1细胞因子(IFN-γ和IL-2)水平升高，蛋白尿与IFN-γ和IL-2存在显著的正相关，eGFR与血浆IFN-γ之间呈负相关，表明Th1细胞因子参与DKD患者的组织损伤。DKD患者血清中的Th2细胞因子(IL-10)水平升高，并且提示IL-10水平与蛋白尿之间存在相关关系[17]。DKD患者尿蛋白/肌酐与 Treg细胞比例呈负相关，T2DM和DKD患者Treg细胞水平下降，血肌酐和血尿素氮与 Treg细胞呈负相关[18]，证实了Treg细胞在糖尿病及其肾脏损害中的重要作用。T淋巴细胞通过分泌多种促炎性细胞因子，激活或招募其他免疫炎性细胞参与DKD发病。不同T细胞亚型之间相互调节，一旦平衡打破就会产生组织及器官的损害，涉及调节免疫应答的分子机制，将会为治疗DKD提供新的依据。

图1 T细胞与肾脏损伤Fig 1 T cells and kidney injury

2.2 组织修复过犹不及-2型固有淋巴细胞(ILC2)

固有淋巴细胞(innate lymphoid cell,ILC)是由共同淋巴样祖细胞发育而来的一种非B、非T细胞的新型淋巴细胞，不表达谱系发育分子(lineage,Lin-)也不表达抗原特异性受体(TCR或BCR)。ILCs细胞多为组织驻留淋巴细胞，分布于肠道、皮肤、肺脏等黏膜屏障部位，参与黏膜免疫的形成、淋巴细胞的发育、组织损伤的修复及上皮屏障的保护作用[19]。一旦其数量或功能异常，将参与炎性反应、免疫性疾病、代谢性疾病、哮喘和过敏[20]等疾病的发生发展。在T、B淋巴细胞缺陷的RAG基因敲除小鼠(recombination activating gene,RAG)中发现ILC2，ILC2受Il-33刺激后分泌细胞因子IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等参与肝纤维化和肺纤维化[21]。

近来也发现其在肾脏疾病尤其是DKD的机制中发挥重要作用[22]。探究ILC2对肾脏影响的研究表明，与对照组的缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)小鼠相比，IL-33治疗的IRI小鼠血清和肾脏中的IL-4和IL-13水平升高，并且ILC2、Treg和巨噬细胞增多；小鼠模型中离体扩增的人ILC2转移可改善肾IRI，但长期会引起肾脏纤维化[23-24]。后来观察到DKD患者与单纯T2DM相比：ILC2百分比显著升高、IL-5、IL-13升高、腰围、空腹血糖、舒张压和三酰甘油升高，推测ILC2可能通过影响血压和脂质代谢参与糖尿病肾脏损害[25]。为探究ILC2参与DKD的途径[26]：与对照组(无DM的健康志愿者)相比，DM组、DKD组外周血中ILC2及细胞因子IL-4、IL-5、IL-13明显增加，IL-4刺激可以以浓度依赖性和时间依赖性的方式促进TGF-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达；并且观察到晚期DKD上述指标明显高于早期DKD。ILC2在器官纤维化中的重要作用，为延缓DKD进展提供了新的治疗思路，以期应用免疫抑制及靶向药物延缓肾脏纤维化。

3 问题与展望

ELMO1rs741301和饮酒之间的基因-环境相互作用组合，为未来研究更多基因环境组合提供参考，SLC12A3为预测白蛋白尿进展风险提供可能，尽管SNP与疾病并不是简单“一对一”关系，但随着对SNP研究的不断深入，未来在明确SNP与DKD相关性的基础上, 可对稳定的SNP进行检测, 反映机体罹患DKD的风险。肾脏的慢性炎性反应始终是DKD的重要病理生理基础，T细胞亚群在胰岛素抵抗和肾脏炎性反应中起重要作用，ILC2细胞影响脂质代谢、参与肾脏纤维化，抑制免疫细胞可以改善胰岛素抵抗、脂质代谢和肾脏炎性反应，故未来针对免疫细胞的抑制剂及靶向治疗，将为治疗DKD提供新的思路。