维生素C对克氏原螯虾肝胰腺非特异性免疫的影响

米少辉 尹欣茹 李军涛 张泽龙 冼健安 王冬梅

摘要：为探究维生素C作为饲料添加剂短期投喂克氏原螯虾（Procambarusclarkii）对其肝胰腺非特异性免疫的影响，并寻找出最适的添加量，将规格相同（27g±3g）、健康无伤的克氏原螯虾暂养7d后分5组，对照组投喂基础饲料，4个试验组投喂的饲料为在基础饲料中添加维生素C（添加量分别：0.1、0.2、0.4、0.8g/kg）。投喂5d后，取试验虾肝胰腺进行免疫相关酶活指标的测定，结果显示：添加0.2g/kg的维生素C可以显著提升克氏原螯虾肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，对于免疫酶ACP、AKP的活力依然有显著提升作用。并且对于肝胰腺中MDA的含量有降低作用（P<0.05）。0.4g/kg添加组，能够显著提升肝胰腺中CAT活力，并且显著降低MDA含量（P<0.05）。由此可以得出在饲料中添加0.2～0.4g/kg维生素C可以在一定程度上提升克氏原螯虾肝胰腺的非特异性免疫。

关键词：维生素C;克氏原螯虾;非特异性免疫

目前，维生素C作为饲料添加剂[1]，在鱼[2-4]、虾[5-6]、海参[7]、中华鳖[8]均有所研究，在饲料中适当比例的添加维生素C投喂，均已证明适量添加维生素C可以增加水生生物的非特异性免疫以及抗应激能力。但是发现其共同特点是均投喂30d以上，投喂时间较长。添加维生素C饲料短期投喂水生生物，对其非特异性免疫影响的研究较少。因此本试验旨在探究饲料中添加不同水平的维生素C，投喂5d，对克氏原螯虾非特异性免疫的影响，进而使维生素C能更大限度地发挥作用，得以应用。

1材料与方法

1.1试验材料

试验用的克氏原螯虾（平均体重27.0g±3.0g）来源为海南归耕田农业科技有限公司。试验用水族箱大小为60cm×43cm×36cm。试验用维生素C由海口蓝海中渔生物科技有限公司提供。

1.2试验饲料

试验所用基础饲料为虾料专用配合饲料（粗蛋白≥28.0%，粗脂肪≥3.0%，粗纤维≤10.0%，粗灰分≤18.0，0.6%≤总磷≤1.4%，钙0.5～5.0，水分≤12.5%）。试验组饲料为在基础饲料中分别添加0.1、0.2、0.4、0.8g/kg的维生素C。

1.3试验仪器

超氧化物歧化酶（SOD）测定试剂盒、微量丙二醛（MDA）测定试剂盒、总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒、过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒、酸性磷酸酶（ACP）测定试剂盒、碱性磷酸酶（AKP）测定试剂盒、蛋白定量（TP）测定试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司。生理盐水（已提前配制）。

台式高速冷冻微量离心机、全波长酶标仪、可见紫外分光光度计、数显恒温水浴锅、多样品组织研磨机、电子天平、2.5mL无菌注射器、1mL无菌注射器（江西三鑫医疗科技有限公司生产）、1.5mLAxygen离心管、高压灭菌锅、增氧机、移液枪等。

1.4饲养管理

将购买的克氏原螯虾在大小为60cm×43cm×36cm，水深15cm的水族箱暂养7d后，挑选健康强壮、规格一致的克氏原螯虾，共分为5组（编号A—E），每组3个重复，每个重复在试验箱中养殖克氏原螯虾15尾。A组为对照组，投喂基础饲料，各试验组饲料中维生素C添加量分别为：B组0.1g/kg，C组0.2g/kg，D组0.4g/kg，E组0.8g/kg。养殖期间水温为23～26℃。在水族箱中增加适量的遮蔽物，防止试验期间成虾自相残杀。试验用水为曝气的自来水，水体pH值控制在7.5左右。养殖期间均充气养殖，除投喂饲料有区别外，其他变量保持一致。每天早晚投喂两次且以晚上投喂量为主，投喂量为成虾体重的3%～5%，各组间投喂量保持一致，具体以实际吃食情况为准。暂养结束后开始投喂试验，在投喂5d后，在3个平行的箱子各取3尾克氏原螯虾，取其肝胰腺进行酶活等生理生化指标检测。

1.5样品的采集与制备

解剖螯虾，取适量肝胰腺，用0.85%氯化钠生理盐水清洗去除污物，用滤纸吸干水分后置于离心管中放入液氮快速冷冻，然后转入-80℃冰箱保存，备用。

1.6相关免疫酶活性指标测定

超氧化物歧化酶（SOD）、总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛含量（MDA）、酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）按照试剂盒的说明进行检测。

1.7数据分析

用Excel2019求得试验数据的平均值以及标准差，利用软件SPSSStatistics18.0进行单因素方差分析（one-wayANOVA）和Duncan多重比较，试验结果以平均值±标准误（Mean±SD）表示，（P<0.05）为差异性显著。

2结果与分析

2.1饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺SOD活力的影响

随着饲料中维生素C添加量的增加，克氏原螯虾肝胰腺中SOD活力呈现出先升高后降低的趋势，其中在饲料中添加0.2g/kg维生素C能够显著增强克氏原螯虾肝胰腺SOD活力（P<0.05），其他各維生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图1。

柱上标不同字母表示差异显著（P<0.05），相同字母表示差异不显著（P>0.05），下同。

2.2饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺MDA含量的影响

随着饲料中维生素C添加量的增加，克氏原螯虾肝胰腺中MDA含量呈现出先降低后升高的趋势，其中在饲料中添加0.2、0.4g/kg维生素C能够显著降低克氏原螯虾肝胰腺中MDA的含量（P<0.05），其他各维生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图2。

2.3饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺CAT活力的影响

随着饲料中维生素C添加量的增加，克氏原螯虾肝胰腺中CAT活力呈现出先升高后降低的趋势，其中在饲料中添加0.2、0.4g/kg维生素C能够显著增强克氏原螯虾肝胰腺CAT活力（P<0.05）。0.2g/kg添加组肝胰腺CAT活力最高，显著高于其他试验组和对照组（P<0.05）。除0.2、0.4g/kg添加量外，其他各维生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图3。

2.4饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺AKP活力的影响

随着饲料中维生素C添加量的增加，克氏原螯虾肝胰腺中AKP活力变化趋势为随着维生素C添加量的增加，AKP活力先升高后降低，当在饲料中添加0.2g/kg维生素C时，肝胰腺中的AKP活力最高，并且显著高于对照组，可见，在饲料中添加0.2g/kg维生素C能够显著增强克氏原螯虾肝胰腺AKP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加组外，其他各维生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图4。

2.5饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺ACP活力的影响

随着饲料中维生素C添加量的增加，克氏原螯虾肝胰腺中ACP活力变化趋势为随着维生素C添加量的增加，ACP活力先升高后降低，当在饲料中添加0.2g/kg维生素C时，肝胰腺中的ACP活力最高，并且显著高于对照组，可见，在饲料中添加0.2g/kg维生素C能够显著增强克氏原螯虾肝胰腺ACP活力（P<0.05）。除0.2g/kg添加组外，其他各维生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图5。

2.6饲料中维生素C添加量对克氏原螯虾肝胰腺T-AOC变化的影响

克氏原螯虾肝胰腺中的总抗氧化能力，随着饲料中维生素C添加量的增加，呈现出先升高后降低的趋势，其中肝胰腺T-AOC在维生素C添加量为0.2g/kg时最优，当在饲料中添加0.2g/kg维生素C时，肝胰腺中的T-AOC显著高于对照组，可见，在饲料中添加0.2g/kg维生素C能够显著增强克氏原螯虾肝胰腺T-AOC（P<0.05）。除0.2g/kg添加组外，其他各维生素C添加组与对照组相比均不存在明显差异（P>0.05）。见图6。

3讨论

SOD和CAT是生物体内抗氧化指标的指示酶，在机体内主要参与机体内自由基的清除，从而维持机体内自由基的动态平衡[9]。MDA是自由基引起脂质过氧化所产生的产物，其含量的高低可以间接反应机体自由基的含量以及脂质的过氧化程度[10]。T-AOC反应抗氧化系统整体水平，主要抑制过氧化链产生，达到消除自由基的效应[11]。AKP和ACP是生物体内巨噬细胞溶酶体的标志酶，主要参与磷酸基团的转移和代谢，在免疫系统中也发挥着重要作用，同样可以间接反应机体的免疫能力[12]。另外，甲壳动物氧化代谢的主要场所为肝胰腺而非血清[13]，所以本试验主要研究维生素C添加对肝胰腺中免疫指标的影响。

有研究表明维生素作为饲料添加剂的应用具有增强虾类免疫力以及抗氧化能力的重要作用，并降低机体的应激性，增加对外界环境因子剧烈变化的抵抗能力[14]。王伟庆等[15]研究发现，在中国对虾的饲料中添加适量的维生素C衍生物维生素C多聚磷酸酯（LAPP），能够提高其抵抗副溶血弧菌的能力，提高其机体的免疫性能。另外，LAPP的添加提高了中国对虾血细胞吞噬金黄色葡萄球菌的能力，表明其对细菌感染的抗病性得到提高。宋理平等[16]的研究表明，维生素C能够增加中国明对虾（Penaeuschinensis）幼体的免疫力。维生素C和β-葡聚糖协同使用，使对虾幼体对于哈维氏弧菌的抵抗力增强，同时增强了免疫酶的活性以及提高了免疫保护率。王文婧等[17]研究发现，大剂量投喂维生素C能够提高凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）肝胰腺溶菌酶（LZM）和酸性磷酸酶（ACP）的活性，对于轻度拥挤胁迫造成的凡纳滨对虾免疫机能的变化有一定的缓冲作用，但是不能消除胁迫对其所造成的影响。Kong等[18]研究发现，在克氏原螯虾日粮中添加250.12mg/kg和321.38mg/kgVc均能提升克氏原螯虾的非特异性免疫。上述研究与本试验结果相一致。

4结论

在本试验中，添加0.2g/kg的维生素C可以显著提升克氏原螯虾肝胰腺中SOD、CAT、T-AOC等抗氧化酶的活性，对于免疫酶ACP、AKP的活力有显著提升作用，并且对于肝胰腺中MDA的含量有降低作用。0.4g/kg添加组，能够显著提升肝胰腺中CAT活力，并且显著降低MDA含量。由此可以得出，在饲料中添加0.2～0.4g/kg维生素C可以在一定程度上提升克氏原螯虾肝胰腺的非特异性免疫。

参考文献：

[1]王孝忠.水产饵料添加剂——世界最新型高稳定性维生素C源LAPP研制成功[J].饲料研究，1991（2）：31.

[2]王贞杰，叶保民，常青，等.饲料维生素C含量对圆斑星鲽幼鱼抗氨氮胁迫能力的影响[J].动物营养学报，2016，28（12）：4054-4062.

[3]韦海明.黄芪和维生素C对大黄鱼抗应激的影响[D].青岛：中国海洋大学，2014.

[4]明建华.大黄素和维生素C对团头鲂生长、非特异性免疫以及抗应激的影响[D].南京：南京农业大学，2011.

[5]陈亚坤.Vc对拥挤胁迫下南美白对虾免疫机能的影响[D].保定：河北农业大学，2011.

[6]田立立.饲料中添加维生素C对克氏原螯虾生长和高pH胁迫的影响[D].扬州：扬州大学，2021.

[7]王晶.维生素C对刺参（Apostichopusjaponicus）镉中毒的缓解作用研究[D].大连：大连海洋大学，2016.

[8]聂月美.饲料维生素C对中华鳖免疫、抗应激和体组成的影响[D].杭州：浙江大学，2006.

[9]赵红霞，陈启明，黄燕华，等.饲料精氨酸水平对黄颡鱼幼鱼生长性能、消化吸收相关指标、免疫功能和抗氧化能力的影响[J].动物营养学报，2018，30（12）：5040-5051.

[10]陈科全，叶元土，蔡春芳，等.饲料丙二醛对草鱼生长、肝胰脏及肠道结构和功能的影响[J].水生生物学报，2016，40（4）：779-792.

[11]翟少伟，史庆超，陈学豪.饲料中添加抗菌肽Surfactin对吉富罗非鱼肠道健康的影响[J].水生生物学报，2016，40（4）：823-829.

[12]朱旭枫，黄洋，黄俊杭，等.水解单宁对珍珠龙胆石斑鱼生长性能、抗氧化能力、肠道组织结构与菌群多样性的影响[J].动物营养学报，2021，33（2）：1020-1035.

[13]王麗，韩艳楠，金珊，等.水体Cu2+对三疣梭子蟹主要组织ROS含量和抗氧化能力的影响[J].农业环境科学学报，2015，34（7）：1261-1268.

[14]赵文.维生素C与水产养殖[J].饲料博览，1995（5）：35-38.

[15]王伟庆，李爱杰.LAPP对中国对虾（Penaeuschinensis）生长，缺氧耐受力免疫抵抗力的影响[J].海洋湖沼通报，1996（1）：42-49.

[16]宋理平，周洪琪，黄旭雄，等.Vc及其与β-葡聚糖混合物对中国明对虾生长和免疫功能的影响[J].饲料工业，2006，27（4）：35-39.

[17]王文婧，郭冉，夏辉，等.大剂量维生素C对拥挤胁迫下凡纳滨对虾免疫因子的影响[J].江苏农业科学，2012，40（5）：202-206.

[18]KONGFS，ZHUYH，YUHJ，etal.EffectofdietaryvitaminConthegrowthperformance，nonspecificimmunityandantioxidantabilityofredswampcrayfish（Procambarusclarkii）[J].Aquaculture，2021，541：736785.

（收稿日期：2021-09-30;修回日期：2021-12-16）