黄曲霉毒素B1脱毒技术的研究进展

孔令露，梁 幸，沈贺彬

(福建师范大学生命科学学院， 福建 福州 350117)

民以食为天，食以安全为先，食品安全与社会稳定及人类的健康密切相关。据联合国粮食与农业组织(Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO)数据显示，全球约有25%粮食农作物受到真菌毒素的污染[1]。真菌毒素(Mycotoxin)是由真菌产生的天然次级代谢产物，世界卫生组织( World Health Organization, WHO) 将其对食品与饲料造成的污染列为食源性疾病的重要根源[2]。黄曲霉毒素(Aflatoxin，AF)主要是由黄曲霉Aspergillusflavus、寄生曲霉Aspergillusparasiticus和诺氏曲霉Aspergillusnomius等真菌产生的有害毒素[3]。已鉴定的黄曲霉毒素种类有20多种，常见的主要有AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和AFM1等，且毒性从大到小依次是：AFB1>AFM1>AFG1>AFB2>AFG2，其中黄曲霉毒素B1( Aflatoxin B1, AFB1)作为毒性最强的生物毒素，毒性约为氰化钾(KCN)的10倍和砒霜(As2O3)的68倍[4]，可在人或动物体内蓄积，具有致畸、致癌、致突变等作用，1993年被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer, IARC)定为I级致癌物质，目前是人们公认天然毒性最强的化合物之一[5]。AFB1污染给人类健康和经济发展造成了巨大的威胁，如何降低食品中黄曲霉毒素B1的含量，减少其带来的危害成为当下食品安全的一大难题。目前主要的脱毒方法包括物理、化学以及生物法，不同的脱毒方法各有其优缺点，本文将对3种主要的脱毒手段和优缺点加以概述，旨在为今后更好地认识和去除AFB1提供理论参考。

1 AFB1毒性位点分析

AFB1作为剧毒化合物，是由1个双呋喃环和1个氧杂萘邻酮组成的香豆素衍生物，其含有3个毒性位点(图1)，毒性位点1位于双呋喃环上的第8、9双键上，且是AFB1高毒性的关键[6]，该位点主要是与DNA/RNA和蛋白质共价结合形成加合物，从而影响细胞的代谢，同时也是导致基因突变的主要功能基团；毒性位点2位于香豆素内酯环上的10、11、15位点，该位点易发生水解反应生成含双呋环结构的AFD1；毒性位点3位于环戊烯酮环上的1、2、3、14位点上，该位点容易被取代基所取代，如发生酮羰基还原、加成作用等反应来改变AFB1的毒性。因此，破坏3个相应的毒性位点成为了AFB1减毒、脱毒的重要关键。

图1 黄曲霉毒素B1的结构Fig.1 Structures of Aflatoxin B1

2 AFB1污染情况分析

黄曲霉毒素B1的污染是一个全球性的问题，AFB1引起的食品污染问题时常发生，根据过去10年全球污染率的数据统计，AFB1污染最高浓度达1 642 μg·kg-1，其中水稻污染率位居第3，平均有55.4%的水稻样本被AFB1污染[7-8]。Bansal等[9]对加拿大199份水稻样本进行检测，其中56份样本呈现AFB1阳性，浓度达7.1 μg·kg-1。此外，饲料和部分农产品也常受到AFB1的污染，被污染的饲料和农产品通过食物链的传递将导致AFB1在人体内直接或间接的蓄积。目前已超过百种农产品和食品检测出受到AFB1的污染，尤其是在气候湿热的地区，部分热带和亚热带地区AFB1的污染情况见表1。

表1 部分热带和亚热带地区食品和饲料样品中AFB1的污染Table 1 AFB1 contamination in the food and feed samples from some tropical and subtropical zones

3 AFB1脱毒方法的比较

考虑到食品安全问题，许多国家和地区规定了食品和饲料中AFB1含量的限量标准，国际上欧盟规定AF的限量标准范围为4～15 μg·kg-1，AFB1的允许范围为0.1～12 μg·kg-1，美国食品和药品管理局将AFB1在食品中的最高限量标准设定为20 μg·kg-1[18]。各组织及国家关于食品中AFB1的限量标准见表2[18-19]。

表2 各组织及国家食品中对黄曲霉毒素B1的限量Table 2 Limits of Aflatoxin B1 in the foods from various organizations and countries

目前去除AFB1的方法主要包括物理、化学和生物法，各脱毒方法各有其优缺点，表3列出了AFB1常用的脱毒方法的比较。

表3 AFB1脱毒方法的比较Table 3 Comparison of AFB1 detoxification methods

3.1 物理脱毒

3.1.1吸附 吸附脱毒主要利用吸附剂吸附毒素来减少饲料以及农副产品中毒素的含量，从而达到减毒效果，但不能降低毒素，无法彻底解决毒素污染问题。传统的吸附剂包括硅胶、黏土、沸石、氧化铝等，新型的吸附剂包括纤维素、壳聚糖及硅铝酸盐类等有机物。近年来，经过不断的探索，纳米技术已应用于吸附剂，如磁性吸附剂，其吸附容量和材料稳定性已远远提高[36]。Pirouz等[37]利用磁性氧化石墨烯纳米复合材料(MGO)的吸附作用来减少镰刀属真菌毒素的污染。对于新材料和新技术的探索在不断增加，Scaglion等[20]采用22中心复合旋转设计，提出了使用稻壳作为吸附剂来去除AFB1，用0.5 g大小为42目的稻壳吸附10 mL被黄曲霉毒素B1和M1污染的牛奶，平均吸附量约为0.0150 μg·g-1AFB1和0.0174 μg·g-1AFM1，且吸附剂基本能达到100%回收率。吸附剂虽成本低，且能重复利用，但因其特殊的选择性、可逆性以及不稳定性，且反复洗脱可以使毒素游离出来，很少在工业化上应用。

3.1.2辐射 辐射脱毒主要是利用紫外线、X射线、γ射线以及微波等手段杀灭微生物或破坏其产生的毒素分子结构，从而减弱其毒性。最为常见的方法是紫外线辐射，通过破坏真菌的蛋白质和核酸结构，使其在代谢过程中发生紊乱，从而抑制产毒真菌的生长[38]，从根源上减少毒素的污染。Gillani等[17]先后用辐射、日照以及紫外线复合处理被真菌毒素污染的玉米，去除率几乎达到100%。紫外线辐照对真菌毒素的去除效果良好，且几乎不会破坏食品中的品质，在食品行业中具有广阔的应用前景。

γ射线是比较常见的辐射脱毒方法，Ferreira-Castro等[39]用5 kGy剂量的γ射线能够有效地抑制镰刀属真菌的生长，扫描电镜结果显示菌丝体受到辐射损伤，当辐照剂量增加到10 kGy时，镰刀菌毒素完全被降解。Chanem等[21]研究了γ 射线对食品和饲料中AFB1的影响，数据显示，辐照剂量为10 kGy的γ射线对玉米、大麦中AFB1的去除率分别为84.23%和89.86%。Wang等[40]用Co60γ射线处理含20 μg·L-1AFB1的甲醇水溶液(60∶40，V甲醇∶V水)，用高效液相色谱-四极杆飞行时间光谱仪获得20多种放射性产物的分子量和分子式，且提出了7种关键的放射性产物的可能形成途径。γ射线虽脱毒效率高且能实现工业化应用，但高剂量的辐射可能会破坏食品质感，同时存在一定的安全隐患，因此，其对处理过程环境要求十分严格。

3.1.3热处理 热处理脱毒主要是通过高温破坏真菌毒素的分子结构，达到减毒的目的。利用高温脱毒是早期最常用的手段之一，其主要包括干燥、蒸煮、烘烤等。AFB1耐受温度高于235℃，对高温具有很强的抵抗力，因此简单的加热不能够完全去除，然而延长加热时间似乎能提高其去除率，如被AFB1污染的花生粕进行焙烤30 min，对AFB1的去除率可达到40%～60%[22]；Lee等[23]用100℃和150℃处理被AFB1污染的大豆90 min，去除率分别为41.9%和81.2%，由此可见热处理去除毒素的效率与温度、加热时间息息相关，同时毒素浓度和样品含水量可能也会影响脱毒的效果。热处理操作简便，但高温伴随大量的热量消耗，增加成本的投入，不适于工业化的应用，同时高温也会影响食品的品质和口感，因此食品工业可能会将研究方向转移到非热处理技术上。

3.2 化学脱毒

化学法脱毒主要是利用添加的化学试剂修饰或破坏毒素的分子结构从而达到脱毒，如O3、酸碱、氨气等对真菌毒素有一定的破坏作用；同时化学脱毒法存在一定的缺陷，会导致化学物质的二次污染，残留的化学物质可能直接威胁人们的健康。

3.2.1臭氧 O3作为强氧化剂，在水溶液中有极强的氧化分解能力。Luo等[41]研究表明O3能够破坏AFB1终端的呋喃环双键，进而降低化合物的毒性，主要是通过-CH3、-OH、-CO等基团的丢失来脱毒。Mohammadi等[25]利用臭氧来降解牛奶中的AFM1，结果显示，O3处理5 min能去除牛奶中50%AFM1，处理时间越长，去除效果越好，牛奶中的微生物总量和β-胡萝卜素含量显著下降，但pH和氧化水平没有明显变化，该文首次报道了臭氧处理牛奶中的AFM1污染问题。O3脱毒法操作简单，且无毒物残留，适用于食品脱毒，但其强氧化性破坏食品中的蛋白质和维生素等成分，该方法不适用于对营养价值要求较高的食品脱毒。

3.2.2碱处理 在碱性条件下，AFB1的内酯环结构十分不稳定，易发生水解，生成水溶性的无毒钠盐，AFB1结构发生改变从而达到减毒的目的。张春华等[26]将受AFB1污染的花生原料浸泡在pH为8～9的碱性溶液中，AFB1的去除率可到达56.73%。同时杨威等[27]也报道用pH为13.40的碱液浸泡四级花生15 min，压榨花生油中AFB1的脱毒效果达93.3%。除此之外，氨气也可以降低其毒性，氨气通过与AFB1发生脱-OH反应，破坏其环状结构，达到解毒目的。氨气来源广泛且能回收利用，具有较大的开发潜力。碱处理脱毒效率高，但碱容易与食品中的化学物质发生反应，在一定程度上会影响食品的口感和品质。

3.2.3天然产物 天然产物是一类由动物、植物、以及微生物产生的次级代谢产物，具有广泛的来源，因此在农业、食品、医药方面得到广泛的应用。近年，利用天然代谢产物来降解生物毒素的研究方向逐渐成为人们的聚焦点。

Anjum等[42]研究了薄荷叶及芽的水提取物对AFB1和AFB2的去除情况，叶提取物对AFB1(100 μg·L-1)和AFB2(50 μg·L-1)的降解率分别为75%、80%；芽提取物对其的降解率仅为40%～48%，通过LCMS/MS分析得到7种AFB1的降解产物，同时MS/MS光谱显示大多数产物是由苯环侧链甲氧基的丢失、呋喃环末端双键的去除和内酯基团的修饰形成，且降解产物对海水虾表现出更低的毒性。Iram等[28]探究柠檬桉水提物对黄曲霉家族B1和B2的降解作用，在pH为8，30℃孵育72 h脱毒率分别为95.21%和92.95%。随后研究了决明子叶水提取物对AFB1和AFB2的降解率分别为90.4%和88.6%[29]，通过MS/MS谱图显示降解产物主要通过末端呋喃环双键的去除以及内酯环的修饰形成。总而言之，天然产物的开发为真菌毒素降解的研究灌入了一个全新的思维。

3.3 生物脱毒

生物法脱毒是目前AFB1脱毒的研究热点，其机制主要是利用细胞吸附、生物转化以及分泌生物酶来减少毒素含量。目前报道能降解AFB1的微生物包括枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis、乳酸杆菌Lactobacillusplantarum、嗜麦芽窄食单胞菌Stenotrophomonasmaltophilia、嗜盐念珠球菌Tetragenococcushalophilus、黑曲霉Aspergillusniger和平菇Pleurotusostreatus等。大多数降解菌株以香豆素作为唯一碳源筛选得到。部分微生物对AFB1的降解情况见表4。

表4 降解AFB1的部分微生物Table 4 Microorganisms partially degrading AFB1

3.3.1生物吸附 有研究表明微生物吸附去除AFB1主要是通过以非共价的方式形成菌体-AFB1复合物，从而来减少毒素的污染。目前，普遍认为微生物吸附主要是与细胞壁中的肽聚糖及多糖分布有关。Li等[30]研究嗜盐酵母菌CGMCC 3790(salt tolerantCandidaversatilisCGMCC 3790)对AFB1的降解机理和动力学，数据显示菌体与20 ng·mL-1AFB1孵育1 h，对AFB1的吸附效率达69.40%。Li等[48]研究报道嗜盐念珠球菌CGMCC 3792(salt tolerantTetragenococcushalophilusCGMCC 3792)通过生物吸附作用1 h可去除54.25% 的AFB1(20 ng·mL-1)。同时Kosztik等[31]研究乳酸杆菌对AFB1和杂色曲霉素(sterigmatocystin，ST)的吸附能力，其中乳酸杆菌Lactobacillus.PentosusTV3 10 min能吸附11.5% AFB1，但对ST吸附率却高于20%，同一菌株对不同毒素的结合潜力存在明显的差异，保守的肽聚糖结构可能是导致差异的关键原因。微生物吸附作用绿色安全，对毒素的去除具有一定的应用前景。

3.3.2生物降解 1967年，Lillehoj等[52]首次报道橙色黄杆菌Flavobacteriumaurantiacum能够降解黄曲霉毒素B1。多数微生物都是酶促生物转化，通过温和绿色环保的方法降低食品中的AFB1浓度。Xu 等[32]从43株细菌中分离筛选得到1株对AFB1降解效率高达92.1% 的沙克氏杆菌 L7(BacillusshackletoniiL7)，并从代谢产物中分离出分子量为22 kDa的胞外酶，该酶在70℃，pH为8.0表现出较高的活性。Wang 等[33]从白腐真菌YK-624(white-rot fungusPhanerochaetesordidaYK-624)中提取到锰过氧化物酶(MnP)，研究表明该酶能够有效地降解AFB1，推测其降解机制：AFB1首先被MnP氧化成AFBO，随后再水解成低毒的AFB1-8，9-二氢二醇，目前未见报道该酶的相关酶学常数Km及Kcat。Eshell等[53]报道在30℃，pH值为6.0的条件下红曲霉与AFB1孵育24 h后，对AFB1的去除效率达到95.9%，同时通过HR-FTMS分析测试表明，AFB1的降解与脂肪酸代谢和糖酵解中间产物的积累有关，并从红曲霉中鉴定出许多关于芳香族化合物的分解代谢途径相关的酶。

3.4 其他脱毒技术

光催化作用已成功用于污水和有机物污染物的降解，其中二氧化钛(TiO2)在光催化降解有机污染物方面具有很大的潜力，但可见光响应差，光生电子-空穴对分离效率低，限制了其广泛的应用。科技在不断地进步，Zhang等[35]通过原位溶剂热法成功制备了TiO2/UiO-67光催化剂，80 min对AFB1的降解率为98.9%，效果优于市售的P25、TiO2和大多数可见光照射下报道的光催化剂。光催化为环境中有机污染物的降解提供一个有效的策略。

4 展望

目前，关于AFB1的降解手段呈现多样化，但随着生物科技的发展，生物法脱毒因其高效安全、绿色环保的特点，将成为未来真菌毒素脱毒手段的聚焦点。因此，未来生物脱毒可朝着以下3个方向延伸：(1)抑制产毒真菌的生长；从根源上减少生物毒素的污染；(2)对生物毒素的生物合成途径进行调控，抑制产毒基因的表达；(3)人工过表达具有降解作用的生物酶。随着降解酶逐渐被发现和研究，降解条件和效果也在不断优化，真菌毒素的研究将会有巨大的发展空间。此外，随着合成生物学技术的成熟和基因编辑技术的发展，研究者们构建出能够表达高附营养价值的细胞工厂(如降解酶、药物蛋白以及生物化学品等)；在食品、药物和环境保护等方面具有巨大的发展潜力，同时可通过基因编辑技术建立降解真菌毒素的专属“细胞工厂”。

此外，关于真菌毒素的生物脱毒仍存在三方面问题：(1)难以筛选到具有高效降解作用的菌株，且实现工业化应用面临巨大的挑战；(2)生物脱毒技术不够完善，对生物酶和活性分子的分离纯化技术欠缺；(3)降解机制和降解产物的种类及其安全性研究较少。通过解决以上3个方面的问题，生物法降解AFB1才能有望在农业生产中得到应用。