1种细菌纤维素基抗菌复合材料的制备及性能评价

林伟铃，胡 丹，朱宏阳，林 勇，王金海

(福建卫生职业技术学院药学院， 福建 福州 350101)

纤维素存在于植物细胞壁中，是自然界中能够找到的最丰富的聚合材料之一[1]。目前，工业所需的纤维素主要来源是木材[2]，生产过程涉及森林的砍伐并且会造成环境污染[3-4]。与植物纤维素相比，由多种微生物产生的细菌纤维素(Bacterial Cellulose, BC) 不含半纤维素和木质素等杂质，是最纯的纤维素形式之一[5]。BC具有高安全性、低成本、高柔韧性和适应性、亲水性、透明性、生物相容性和生物可降解性等优异的物理化学性质[6]。BC在食品、医疗、化妆品、造纸及声学器材等领域工业中有着广泛的应用，特别是在食品方面除了作为食品添加剂，还可作为环保型食品外包装材料[7-11]。 BC可与抗菌剂制备获得抗菌材料，此类复合抗菌材料具备生物可降解性，还能够较好地抑制微生物的生长，可用作医用抗菌敷料，也可用作抗菌食品包装材料。目前，在抗菌食品包装材料上BC抗菌复合材料的研究主要集中于月桂酸/BC、姜黄素/BC、壳聚糖/BC等[12-14]。

ε-聚赖氨酸(ε-Polylysine,ε-PL)是由25～35个L-赖氨酸残基组成的生物聚合物，可被机体完全消化为赖氨酸[15]。ε-PL具有广谱抗菌能力，同时具备生物降解性、低毒性和低成本等特点，可应用于果蔬保鲜、食品防腐以及农业生产上植物病害的防治等领域[16-18]。本课题将ε-PL与细菌纤维素复合制备新型抗菌敷料PLBC复合膜，并对PLBC复合膜进行性能评价和抑菌性能考察，为今后PLBC复合膜在抗菌敷料及抗菌食品包装领域的应用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

细菌纤维素由本课题组制备获得，ε-聚赖氨酸由南京工业大学提供，菌种为大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) [CMCC(B)26003]。

1.2 ε-聚赖氨酸-细菌纤维素(PLBC)复合膜制备

将若干BC膜片浸泡于100 mL一定浓度(0、0.5%、1.0%)的ε-PL溶液中，并将其置于超声清洗器中超声震荡，使BC与ε-PL充分接触吸附均匀，总吸附时间为1 h，分3次重复震荡，间隔时间10 min。将吸附后的膜片放入浓度为15%甘油中，1～2 s后迅速取出，取出后沥干表面多余液体，于60℃烘箱烘干至恒重供测试使用。

1.3 PLBC复合膜结构和性能

1.3.1PLBC复合膜SEM微观结构观察 使用S-3400N型扫描电子显微镜观察PLBC复合膜的微观结构。具体参数为：使用电压为10 kV，工作距离5 400～5 600 μm,将样品固定在铜板上在离子溅射仪中真空喷金，然后观察表面形貌。

1.3.2吸水率和脱水率测定 将1.0 g左右(具体称重记为W1)的BC膜/PLBC复合膜在常温下浸入蒸馏水中，每间隔2 h称其重量，直至恒重。将样品取出后离心分离，称重记为W2，吸水率计算公式如下：

吸水率(%)=(W2-W1)/W2×100。将测定完称重后的样品置于平皿中37℃通风干燥，每隔0.5～1 h称重，至恒重，绘制脱水率曲线。

1.3.3PLBC复合膜的分子结构红外光谱分析 采用傅里叶红外光谱仪测试PLBC复合膜的分子结构。将制备好的膜样品剪取2.5 cm×2.5 cm的方块后，充分干燥，取一定样品研碎后与KBr混合并倒入模具中压片。取样品进行红外光谱的测定，波长范围为400～4 000 cm-1，分辨率为4 cm-1，结合红外光谱数据库对所得红外光谱进行分析。

1.3.4PLBC复合膜的分子结构X射线衍射 用X射线衍射仪分析PLBC复合膜的分子结构。具体参数为：采用Cu靶，加速电压为40 kV，电流强度为200 mA，样间隔0.02°，0.15°·s-1，范围2～60°。

1.3.5PLBC复合膜力学性能测定

(1)PLBC复合膜拉伸强度测定。利用质构仪对PLBC复合膜的拉伸强度进行测定。将膜裁剪成8 cm×1 cm的长条，有效拉伸长度为50 mm，拉伸强度为5 mm·s-1，将复合膜系于拉伸探头上，启动仪器，使探头慢慢向上拉至膜断裂。记录复合膜断裂时的最大张力(F)、伸长距离(L)、应力(σ)、应变(ε)。每个样品做3次平行试验。按下列公式计算拉弹性模量：

E=σ/ε

其中，E表示杨氏模数，σ表示正向应力，ε表示正向应变。

(2)PLBC复合膜断裂伸长率(BE)的测定。如上所述，记录测试样品模断裂时的标线之间的距离L和断裂时膜被拉伸的长度ΔL。按下列公式计算：

BE(%)=ΔL/L×100

1.4 PLBC复合膜抑菌活性测定

1.4.1培养基 LB培养基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，pH 7.4，121℃灭菌20 min。LB固体培养基：酵母膏5 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化钠10 g·L-1，琼脂20 g·L-1，pH 7.4，121 ℃灭菌20 min。

1.4.2菌株活化 于超净工作台中用无菌接种环分别接1环大肠杆菌和金黄色葡萄球菌到装有50 mL LB培养基的三角瓶(250 mL体积)中，200 r·min-1、37℃振荡培养12 h，备用。

1.4.3PLBC复合膜抑菌性能测定

(1)抑菌圈法。将BC膜及PLBC复合膜分别用打孔器打出φ8 mm的圆形膜，置于紫外灯下辐照30 min杀菌备用。取无菌培养皿若干套，每皿加入融化的20 mL LB固体培养基作为底层，凝固。将融化并冷却至45℃左右的LB固体培养基(100 mL)加入50%葡萄糖液1 mL和活化好的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌液3～5 mL，充分混匀，立即取5 mL均匀平铺在已凝固的底层培养基上，凝固成为上层培养基。待培养基凝固后，用无菌镊子将圆形膜分别放置于培养基上，轻轻将膜摊平，盖上平皿盖后，正置于37 ℃培养箱中培养18～24 h，培养结束后用游标卡尺测量抑菌圈直径大小。

(2)吸光度法。于超净工作台中取0.2 mL大肠杆菌或金黄色葡萄球菌菌液(预先培养至对数增长期，大约培养8～10 h)接入装有20 mL无菌LB液体培养基中，分别放入经紫外灯灭菌的BC膜及PLBC复合膜，37℃、120 r·min-1振荡培养，每隔2 h用酶标仪检测培养液吸光度(A660)的变化，检测抗菌膜对指示菌生长的抑制情况。

1.4.4PLBC复合膜的抑菌曲线 内容物溶出试验：将大肠杆菌或金黄色葡萄球菌培养过夜(8～12 h)，无菌生理盐水洗涤2次，离心收集菌体，并重悬于无菌生理盐水中，用无菌生理盐水稀释(A630约为0.6)，分别将0.5%(w/v)的BC膜及PLBC复合膜加入菌悬液中，培养过程中，分别用酶标仪记录吸光度(A260及A280)的变化曲线。

2 结果与分析

2.1 PLBC复合膜的制备

发酵获得的BC(图1A)用粉碎机粉碎后经酸碱酸浸泡，漂白干净后于烘箱烘干获得纯BC膜(图1B)。将BC膜置于不同浓度的ε-PL溶液中，经浸泡吸附并恒温烘干后获得PLBC复合膜(图1C)。从图2可知，加入ε-PL后，膜展现出良好的均一性， PLBC复合膜的色泽及表观形态与BC膜相比未见明显区别。

注：A为发酵获得的BC；B为BC膜；C为PLBC复合膜图1 BC、BC膜与PLBC复合膜表观形态Fig.1 Morphology of BC, BC membrane and PLBC composite membrane

2.2 PLBC复合膜的结构和性能表征

2.2.1PLBC复合膜的微观结构观察 由图2可知，BC膜具有明显的三维网络结构和孔隙结构(图2A)。对比不同ε-PL处理的PLBC复合膜可以发现，当ε-PL浓度为0.5%时，获得的PLBC复合膜仍保持了与BC膜类似的纳米纤维网络结构，网络与孔隙结构均明显(图2B)，当ε-PL浓度提高时至1%时，BC膜吸附ε-PL的量明显增加，ε-PL的结晶增多，获得的复合材料的空间网络结构和孔隙均变差(图2C)，影响了材料的微观结构，因此本研究在制备PLBC复合膜试验中，ε-PL浓度选择0.5%比较适宜。

注：A为BC膜；B为BC膜+0.5%ε-PL；C为BC膜+1%ε-PL图2 BC和PLBC复合膜的SEM图像Fig.2 SEM images of BC and PLBC composite membrane

2.2.2PLBC复合膜吸水率和脱水率分析 分别考察了纯BC膜及PLBC复合膜的溶剂吸收率，吸收率分别为457.19%±5.62%、397.36%±4.77%。PLBC复合膜的溶剂吸收率低于纯BC膜，可能由于ε-PL的吸附，占据了一定的BC膜空间，从而影响了溶剂的吸附，但PLBC复合膜仍然表现出优良的吸收性能。由图3可知，BC膜与PLBC复合膜均在2 h内完成了脱水。

图3 PLBC复合膜脱水速率Fig.3 Dry-down rate of PLBC composite membrane

2.2.3PLBC复合膜红外光谱分析 由图4可知，PLBC复合膜保留了BC膜的特征吸收峰，即3 341 cm-1处由-OH键伸缩振动引起的一个大的吸收带，以及2 897 cm-1处由-CH-伸缩振动引起的吸收峰。而且，从图4B可以看出，ε-PL与BC膜形成了新的氢键吸收峰位于3 341 cm-1处，光吸收强度变大，在1 558 cm-1处存在特征峰是由-NH2振动引起的，说明PLBC复合膜中存在-NH2，因此证明了PLBC复合膜的成功制备。

注： A为BC膜；B为PLBC复合膜图4 BC膜与PLBC复合膜的红外光谱图Fig.4 Infrared spectrogram of BC membrane and PLBC composite membrane

注：A为BC膜；B为PLBC复合膜图5 BC膜与PLBC复合膜X射线衍射分析图谱Fig. 5 X-ray diffraction analysis map of BC membrane and PLBC composite membrane

2.2.5PLBC复合膜力学性能分析 由表1、图6可知，PLBC复合膜的力学特性与BC膜相比较在应力、应变、弹性模量及断裂伸长率方面均有了不同幅度的提高，这意味着ε-PL的加入使得BC膜的韧性及拉伸强度增强，将有利于PLBC复合膜在抗菌食品包装方面的应用。

表1 BC膜与PLBC复合膜的力学性能Table 1 Mechanical properties of BC membrane and PLBC composite membrane

A：BC膜；B：PLBC复合膜图6 BC膜与PLBC复合膜的弹性Fig.6 Elasticity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3 PLBC复合膜抑菌活性测定

2.3.1抑菌圈法 由图7可知，在涂布E.coli的平板上，BC膜周围无抑菌圈，揭开贴于琼脂表面的BC膜，发现膜下方亦有细菌繁殖，说明纯BC膜对E.coli无抑菌活性。PLBC复合膜周围有明显的抑菌圈，膜下方无细菌繁殖(图7A)，说明PLBC复合膜对E.coli具有良好的抑菌活性。当以S.aureus为抑菌活性测试菌种时，PLBC复合膜对S.aureus也具有良好的抑菌活性(图7B)。

注：A为E.coli抑菌试验；B为S.aureus抑菌试验图7 BC膜及PLBC复合膜抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of BC membrane and PLBC composite membrane

2.3.2吸光度法 由图8可知，空白试验中菌体生长曲线与添加BC膜的菌体生长曲线是几乎重叠的，说明纯BC膜对E.coli及S.aureus生长无抑制效果，这与2.3.1中抑菌圈法结果是一致的。PLBC复合膜吸光度曲线与0.5%纯ε-PL吸光度曲线基本接近，说明PLBC复合膜中的ε-PL可以近似完全地释放出来而发挥抑菌效果，也侧面说明了BC膜吸附ε-PL后可以比较好地释放从而产生抑菌作用，PLBC复合膜的抑菌活性来自ε-PL。从结果分析，PLBC复合膜对G+及G-菌都表现出良好的抑菌效果。

A为大肠杆菌；B为金黄色葡萄球菌图8 吸光度法测定PLBC复合膜对E.coli及S.aureus的抑菌效果Fig.8 Determination of the antibacterial effect of PLBC composite membrane on E.coli and S.aureus by using the absorbance method

2.3.3PLBC复合膜对E.coli与S.aureus的抑菌机制 由图9可知，当分别向E.coli菌液中添加BC膜、PLBC复合膜、ε-PL时，PLBC复合膜、ε-PL组的A260及A280均明显高于BC膜组及空白菌悬液试验组，以S.aureus作试验菌时，结果亦与E.coli菌相似。根据文献报道，付萍等[20-21]通过电镜观察发现ε-PL对E.coli与S.aureus的抑菌机制主要为造成细胞膜的损伤。当细胞膜损伤出现孔洞时，菌体中的内容物核酸及蛋白质便会释放出来，通过测定菌液的A260及A280可以检测菌体裂解后核酸及蛋白质的释放情况，反映抑菌试剂的抑菌效果。当PLBC复合膜与ε-PL加入菌悬液后，A260及A280在短时间内迅速上升，说明PLBC复合膜与ε-PL一样具有良好的抑菌活性，也印证了PLBC复合膜对抑菌机制为损伤E.coli与S.aureus的细胞膜。

A为A260；B为A280图9 PLBC复合膜的添加对A260及A280的影响Fig.9 Effect of the addition of PLBC composite membrane on A260及A280

3 讨论与结论

本研究通过超声震荡使BC与ε-PL充分接触吸附后制备出了PLBC复合膜。对PLBC复合膜的各项性能进行考察，发现PLBC复合膜的溶剂吸收率低于BC膜，脱水率则两者相当。观察到ε-PL的结晶会影响PLBC复合膜的微观结构，ε-PL浓度选择0.5%比较适宜。红外光谱分析显示PLBC复合膜保留了BC膜的特征峰，同时存在新的氢键吸收峰以及由-NH2振动引起的特征峰。XRD分析表明ε-PL没有影响BC的结晶结构。在力学特性上，PLBC复合膜的应力、应变、弹性模量及断裂伸长率均较BC膜有了不同幅度的提高。通过抑菌圈法与吸光度法考察了BC膜与PLBC复合膜对E.coli及S.aureus的抑菌作用，PLBC复合膜中的ε-PL可以近似完全地释放出来而发挥抑菌效果。初步检测分析了PLBC复合膜对E.coli与S.aureus的抑菌机制，结果表明PLBC复合膜与ε-PL的抑菌机制一致，可通过损伤细胞膜造成菌体凋亡。本课题制备所得的PLBC复合膜具有良好的性能及抑菌表现，在医用敷料、食品的保鲜包装等众多领域中将具有广泛的应用潜力。