一种应用比率荧光法定量分析水体中亚甲基蓝含量的方法

李 兰，张棵实，白文凤，刘乃青，金 丽*，张建坡*

(1.吉林化工学院 化学与制药工程学院，吉林 吉林 132022；2.吉化北方龙山助剂有限公司，吉林 吉林 132022；3.吉林石化公司研究院，吉林 吉林 132022)

亚甲基蓝是一种常见的吩噻类染料，又名美蓝、品蓝等，广泛应用于化学、生物实验室染色剂和医疗药物等领域.但过量使用亚甲基蓝会导致人体出现亨氏小体贫血、红细胞形态改变以及坏死脓肿等症状.虽然对不同动物的毒性略有差异，但是当亚甲基蓝浓度过量时，会导致动物的死亡[1].美国、欧盟、日本等已相继限制亚甲基蓝的滥用并制订了亚甲基蓝残留量的检测标准，日本规定最大残留限量为10 μg·kg-1，欧盟规定其用于消毒使用的终浓度不能超过0.4 mg·kg-1[2]，因此检测水中的亚甲基蓝残留对环境监测、生态环境保护、绿色养殖具有重要意义[3].目前亚甲基蓝的检测方法主要有表面增强拉曼法(SERS)[4]、高效液相色谱法(HPLC)[5-6]、免疫法[7]、电化学法[8]、比色法[9]、超高效液相色谱-串联质谱联用法[10-11]、分光光度法[12-13].但存在需要复杂的前处理过程、仪器昂贵、检测时间长、灵敏度低等问题，因而需要探索更为便捷、快速、灵敏度高的检测方法.

比率荧光体系[14]采用双发射的强度比作为检测信号，可以提供针对外部干扰的内置校正，并消除仪器引起的负面影响，显著提高方法的灵敏度.与单波长信号的传统荧光分析相比[15]，比率荧光探针具有灵敏度高、稳定性好等优点.基于石墨烯量子点的比率型荧光探针作为比率型荧光体系的后起之秀，其具备了荧光纳米探针的高光学稳定性与荧光效率,并结合了比率荧光探针的优点，在定量和可视化分析中得到了广泛的应用.

以石墨烯量子点与CdTe量子点混合溶液建立比率荧光检测体系(简称CG体系)，讨论了亚甲基蓝与该CG体系的相互作用，并基于亚甲基蓝浓度与CG体系荧光强度的变化呈正比例关系，建立了一种可用于亚甲基蓝定量分析的检测方法.

1 材料与方法

1.1 试验材料

亚甲基蓝购自天津市河东区红岩试剂厂，其他所有试剂均为分析纯，使用前未做任何处理.水为双蒸水(>18 MΩ·cm).

1.2 仪器与设备

F-280荧光分光光度计(天津港东)；紫外分光光度计UV-2550(日本岛津)；pHS-3C型数字酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司).

1.3 实验方法

如文献所述的方法[16]制备了石墨烯量子点和CdTe量子点，并构建CG体系.将30 μL石墨烯量子点与50 μL的CdTe量子点混合，定容到2 mL(pH=8)，测得荧光发射光谱，激发波长380 nm，激发狭缝为5.0 nm，发射狭缝为10.0 nm.向上述构建CG体系中，加入一定量亚甲基蓝溶液，调节pH，孵育2 min后，在上述相同条件下测得荧光发射光谱.

2 结果与分析

2.1 CG体系检测条件的优化

为了得到可靠的分析结果，首先讨论了pH和温度对该亚甲基蓝-CG体系的影响.pH会引起体系中CdTe量子点荧光强度的较大波动，这是由于氢离子会引起CdTe量子点表面的巯基丙酸性质改变，导致CdTe量子点荧光强度降低.但是氢离子对石墨烯量子点荧光强度的影响较小，如图1(a)所示，综合考虑，选择pH为8作为反应条件.此外，研究了向CG体系中加入亚甲基蓝后(加入0.1 g·L-1的亚甲基蓝溶液20 μL)，孵育时间对荧光强度的影响，如图1(b)所示，可见CG体系的荧光强度变化较小，为了得到可信的分析结果，选定孵育时间为2 min.

t/min(a)

pH(b)图1 pH对CG体系的荧光强度影响关系图和孵育时间对CG体系的荧光强度影响关系图

2.2 亚甲基蓝-CG体系的建立

将一系列0.1 g·L-1的亚甲基蓝加入CG体系中，CdTe量子点的荧光发射强度随着亚甲基蓝浓度的增加而逐渐降低，而且CdTe量子点的最大荧光发射波长也随之发生明显的蓝移，但是石墨烯量子点的荧光发射强度和最大荧光发射波长几乎未发生变化，如图2(a)所示.

Wavelength/nm(a)

Concentrations of Methylene blue/(μmol·L-1)(b)图2 加入亚甲基蓝后CG体系的荧光光谱图和相应的线性关系图

此外，亚甲基蓝的浓度与CG体系荧光强度的比值F487 nm/F640 nm之间具有良好的线性关系，如图2(b)所示，回归方程为F487 nm/F640 nm=0.038 64[亚甲基蓝]+0.9459，R2=0.999 5，根据文献[17]计算可得最低检出限为0.2182 μmol·L-1.通过进一步研究(如图3所示)，测定该猝灭体系的最低检出限为0.558 9 nmol·L-1，线性范围为3.13～9.38 nmol·L-1，激发狭缝为5 nm，发射狭缝为10 nm.

Concentrations of Methylene blue/(nmol·L-1)图3 亚甲基蓝浓度与CG体系荧光强度变化(F487 nm/F640 nm)的关系图

2.3 亚甲基蓝与CG体系作用机理探讨

由图2可知，将亚甲基蓝加入CG体系中，CdTe量子点的荧光强度会发生明显的降低，但是石墨烯量子点的荧光强度变化不大，这是建立本比率荧光法定量分析亚甲基蓝的前提条件.为了进一步研究该体系的检测机理，研究了孵育温度为20 ℃和30 ℃时，不同浓度亚甲基蓝对CdTe量子点荧光强度的影响，如图4所示.

Concentrations of Methylene blue/(mg·L-1)图4 不同孵育温度对亚甲基蓝-CdTe量子点体系荧光强度影响关系图

随着亚甲基蓝浓度的增加，CdTe量子点荧光强度逐渐降低，且荧光强度的变化与亚甲基蓝的浓度之间具有较好的线性关系，随着温度升高，回归线的斜率变小了.由此可推断亚甲基蓝所引起CdTe量子点荧光强度的降低为静态猝灭过程，即亚甲基蓝与CdTe量子点之间形成了复合物，随着温度的升高，复合物稳定性降低，猝灭效率降低，即斜率减小.为了进一步证明以上推断，测定了CdTe量子点溶液中加入亚甲基蓝前后的紫外可见吸收光谱，如图5所示.结果表明，加入亚甲基蓝溶液后，CdTe量子点的最大吸收波长发生了明显的变化，说明有新的复合物生成，即亚甲基蓝和CdTe量子点之间生成了复合物.

Wavelength/nm图5 亚甲基蓝加入CdTe量子点溶液前后的紫外可见吸收光谱图

此外，根据许金钩提出的荧光猝灭可分为静态猝灭过程和动态猝灭过程，均符合公式F0/F= 1 + Kqτ0M= 1 + KsvM，其中τ0代表量子点的平均荧光寿命，M代表亚甲基蓝的浓度，Kq代表荧光衰减常数，Ksv代表回归线的斜率.测得荧光衰减曲线后(谱图未给出)，通过平均加权计算法得到了CdTe量子点的平均荧光寿命为20 ns[18].通过公式Kq=Ksv/τ0可得20 ℃和30 ℃时的Kq分别为2.121×1012和1.192×1012，均大于最大静态猝灭常数(2×1010mol·L-1·s-1)，说明为静态猝灭过程.综上所述，通过变温实验、紫外可见吸收光谱和计算均证明，亚甲基蓝与CdTe之间生成了复合物，引起CdTe量子点荧光静态猝灭.

2.4 实际样品分析

通过测定一些金属离子对该比率荧光体系荧光强度的影响，考察了该方法的选择性.研究发现水中常见的钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、氯离子、硫酸根离子均不会对体系荧光产生明显的影响，即荧光强度不会增大或减小.虽然三价/二价铁离子、铜离子、锰离子会同时引起量子点荧光强度的增大或减小，但是荧光强度比不会发生明显的变化，这说明该比率荧光法用于亚甲基蓝的检测具有较好的选择性.

将该荧光体系用于实际样品的分析，水样为模拟废水，即向去离子水中加入确定量的亚甲基蓝溶液得到样品，分析结果如表1所示.回收率为97.60%-101.3%，说明本方法可以用于样品中亚甲基蓝的定量分析.

表1 水样中亚甲基蓝含量分析

3 结 论

成功地采用石墨烯量子点和CdTe量子点建立了一种比率荧光检测方法，可用于水体中亚甲基蓝的定量分析，最低检出限为0.558 9 nmol·L-1.并采用变温实验、紫外可见吸收和计算对亚甲基蓝和CdTe量子点之间的相互作用机理进行了讨论，证明亚甲基蓝所引起的CdTe量子点荧光强度的降低为静态猝灭过程.研究表明，该比率荧光法用于亚甲基蓝的定量分析具有较好的灵敏度和选择性，可用于实际水样中亚甲基蓝含量的分析.