葛根素通过调节钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ减轻布比卡因诱发的心肌损伤研究*

于 妍，王春爱△，李玉兰，梁 曦，温晓辉

1 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2 兰州大学第一医院；3 甘肃中医药大学

布比卡因是一种长效酰胺类局麻药，广泛应用于各种手术［1］。布比卡因误入静脉或过量使用会带来明显的心脏毒性，表现为恶性心律失常、心肌收缩力下降、循环衰竭甚至心脏骤停［2］。钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）是一类多功能丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶［3］，广泛分布于心肌组织，在维持细胞内钙稳态方面发挥重要作用，参与心肌心律失常、细胞凋亡、心肌肥厚、心力衰竭的发生、发展过程［4-7］。本实验通过观察葛根素干预布比卡因致心肌细胞损伤模型的心肌细胞CaMKⅡ磷酸化水平、Ca2+浓度、细胞凋亡率，探讨葛根素是否通过调节CaMKⅡ减轻布比卡因诱发的心肌损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性Wistar 大鼠40 只，6 月龄，体质量250～300 g，由兰州兽医研究所实验动物中心提供（SCXK［甘］2019-0002）。大鼠麻醉前禁食8 h，自由饮水，腹腔注射10% 水合氯醛3 mL/kg进行麻醉。大鼠仰卧位固定于实验台，左侧股静脉置入24 G 套管针用于给药，右侧颈动脉置入24 G套管针用于监测动脉血压及采集血样，采用PowerLab系统监测血压和Ⅱ导联心电图。

1.2 布比卡因中毒模型建立参照文献［7］方法建立布比卡因中毒模型，经股静脉2 min 内输注0.5% 布比卡因10 mg/kg，Ⅱ导联心电图出现心律失常（频发室性早搏、室性心动过速、QRS 延长20%）表明模型建立成功。

1.3 实验分组与处理采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组（C 组）、布比卡因中毒模型组（B 组）、葛根素预防组（P 组）、葛根素治疗组（T组），每组10 只。C 组经股静脉输注0.9% 生理盐水3 mL/kg，B组股静脉输注0.5%布比卡因10 mg/kg，出现心律失常后输注0.9% 生理盐水3 mL/kg，P 组股静脉输注葛根素3 mL/kg 5 min后输注0.5%布比卡因10 mg/kg，T组静脉输注0.5%布比卡因10 mg/kg，出现心律失常后立即输注葛根素3 mL/kg。C组在开始输注生理盐水的第8 min 及B、T、P 组在开始输注利多卡因的第8 min，处死大鼠。

1.4 酶联免疫吸收测定法（ELISA）组织样品在PBS 中匀浆后离心获得上清液，37℃孵育30 min，用酶标记剂冲洗、孵育、显色。反应结束后测量各孔吸光度，估算样品Ca2+浓度。

1.5 蛋白质印迹法（Western blot）组织样品匀浆后取上清液，用蛋白提取试剂盒（碧云天生物技术公司，批号：P0033）分离总蛋白。蛋白浓度测定后，总蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。然后将蛋白质转移到聚偏氟乙烯膜上，用p-CaMKⅡ一抗（santacruze，批号：sc-32289）和辣根过氧化物酶标记二抗（碧云天生物技术公司，批号：A0208）37℃分别孵育1 h，用增强化学发光法获得Western blot图像。用Image J软件分析靶蛋白条带灰度。

1.6 TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法组织样本石蜡切片置于二甲苯逐级脱蜡，乙醇梯度脱水，再蒸馏水清洗。运用光学显微镜获得图像，每张切片随机选取5个高倍视野（×400），计数各组凋亡细胞，并计算凋亡指数（Apoptosis index，AI）。

1.7 统计学方法采用SPSS 20.0 分析数据，计量资料以±s表示。组间多重比较采用单因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ的蛋白表达与C 组比较，B 组心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ蛋白表达升高（P＜0.05）。与B 组比较，P组心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ蛋白表达降低（P＜0.05），T组心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ蛋白表达降低，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 4组大鼠心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ蛋白表达（±s）

表1 4组大鼠心肌细胞钙离子浓度及p-CaMKⅡ蛋白表达（±s）

注：*表示与C组比较，P＜0.05；#表示与B组比较，P＜0.05

组别C组B组P组T组鼠数10 10 10 10 Ca2+浓度0.38±0.05 0.49±0.01*0.41±0.07#0.45±0.04 p-CaMKⅡ/CaMKⅡ1.00±0.04 1.55±0.02*1.16±0.03#1.32±0.02

图1 4组大鼠心肌心肌细胞p-CaMKⅡ蛋白表达

2.2 心肌细胞凋亡凋亡心肌细胞的细胞核呈棕褐色，而非凋亡心肌细胞的细胞核呈蓝色。与C 组相比，B 组心肌细胞凋亡指数增加（P＜0.05）。与B 组比较，P 组凋亡细胞减少（P＜0.05），T 组的凋亡细胞数量减少，但凋亡指数差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2、表2。

表2 4组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较（±s） %

表2 4组大鼠心肌细胞凋亡指数的比较（±s） %

注：*表示与C组比较，P＜0.05；#表示与B组比较，P＜0.05

组别C组B组P组T组鼠数10 10 10 10凋亡指数8.53±1.72 19.24±2.81*13.29±1.28#16.47±2.13

图2 4组大鼠心肌细胞凋亡染色

3 讨论

临床中布比卡因带来的心脏毒性主要表现为恶性心律失常，而延迟后除极（delaged after depolarization，DAD）和早后除极（early after depolarization，EAD）是引发心律失常的关键因素［8］。DAD 发生在动作电位的4 相，而EAD 发生在动作电位复极的2 相或3 相的一次新的除极［9］，Ca2+浓度的变化在该过程中发挥重要作用。病理条件下，CaMKⅡ对内质网上RyR2 受体的S2814 位点过度磷酸化，可使内质网内Ca2+大量泄露，导致心肌细胞凋亡，最终引发心律失常［10-11］。过量的CaMKⅡ激活后可促进线粒体Ca2+增加，导致线粒体膜通透性转换孔异常开放，线粒体能量代谢异常，进一步诱发线粒体介导的心肌细胞凋亡［12］。

葛根素为我国传统中药葛根的提取成分，主要用于治疗心血管系统疾病。现代分子药理学研究表明，葛根素可降低氯仿诱导的昆明小鼠的心颤发生率，使乌头碱所致SD大鼠心搏停止阈剂量、室性期前收缩、室颤、室性心动过速显著提升，对哇巴因致EWG/B 豚鼠同样适用，表明葛根素适合治疗心律失常［13-14］。葛根素还能抑制心肌细胞内游离Ca2+浓度，对心肌具有保护作用［15］。

本研究结果显示，布比卡因具有促进心肌细胞CaMKⅡ磷酸化，致使细胞内Ca2+超载，导致心肌细胞凋亡的作用，从而产生心肌毒性。通过静脉注射葛根素可以逆转布比卡因造成的心肌细胞钙超载、凋亡，保护心肌细胞。且注入布比卡因前预先静脉注射葛根素对心肌细胞的保护作用优于注入布比卡因出现心律失常后再静脉注射葛根素。

可见，布比卡因具有促进磷酸化CaMKⅡ蛋白表达的作用，葛根素减轻布比卡因致心肌细胞损伤可能与其调节CaMKⅡ磷酸化、减轻细胞内Ca2+超载、抑制心肌细胞凋亡有关。但因本实验未设立相关蛋白分子激动剂和抑制剂组，难以得出因果关系。这也是今后进一步研究的方向。