基于全二维气相色谱-四极杆飞行时间质谱高通量检测独活挥发油化学成分

钱沉鱼，陈啸天，肖 雪，周雪倩，王玉梅，向章敏*

（1.华南农业大学 林学与风景园林学院，广东省森林植物种质创新与利用重点实验室，广东 广州 510642；2.广东省科学院测试分析研究所，广东省化学危害应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070）

独活属于伞形科当归属，是当归的干燥根［1］，在中国药典中被列为治疗风湿病的止痛药和类似药物，并用作不同中药处方的重要组成部分［2-3］。现代药理学研究表明，独活具有较好的生物及生理活性，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤、镇静、镇痛等［4-6］。此外，从中药植物中提取分离出的挥发油成分，具有预防和治疗人类各种疾病的功效［7-10］。然而，中药挥发油是非常复杂的天然产物，由成百上千种成分组成。常规的一维气相色谱仪（One-dimensional gas chromatography，1-DGC）在化学分析领域通常作为分离和分析的有效工具之一［11-13］，但是，1-DGC 通常难以成功分离复杂基质中的多种化学组成，即使色谱柱容量远远大于容纳所有样品组分所需的峰容量，也经常发生峰共流出、杂峰干扰、分离度不够等现象［14］。全二维气相色谱（Comprehensive two-dimensional gas chromatography，GC×GC）与1-DGC相比具有更高的色谱分离度和峰容量，成为分离天然植物挥发油复杂成分的有效手段之一［15-16］。目前，GC×GC 已成功用于各种植物挥发油的化学成分分析，如玫瑰木（Aniba rosaeodora）、薰衣草（Lavandula Linn.）、香料（Piper regnellii）等植物挥发油［17-19］，与1-DGC 相比，通过GC×GC 方法鉴定出的化合物更多、更详细、更准确。

本文基于全二维气相色谱-四极杆飞行时间质谱（GC×GC-QTOF MS）对独活挥发油成分进行高通量检测，通过匹配因子、保留指数（RI）和高分辨精确质量数进行定性分析，共鉴定了207 种化学成分，是目前为止分析独活挥发油化学成分最多的方法，为挖掘其更多、更有用的药用价值及综合利用提供了物质基础和检测方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7250 气相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪（美国Agilent 公司），配置SSM1800 固态热调制器（雪景电子科技有限公司）和PAL RSI120三合一自动进样器（瑞士CTC公司）；FW80研磨仪（天津泰斯特公司）；ND100-1 氮吹仪（杭州瑞诚公司）；AL-104 电子天平（美国Mettler-Toledo 公司）；ZNHW-Ⅱ电热套（巩义予华仪器有限公司）以及其他常用玻璃仪器。

甲醇、正己烷（色谱纯，美国Merck 公司）；无水硫酸钠（分析纯，广州化工厂）；超纯水（自制）；正构烷烃标准品（C8～C25，纯度≥99.5%）、十六酸甲酯（纯度＞98.5%）、苯乙醛（纯度＞90%）均购于Sigma-Aldrich Fluka 公司；α-蒎烯（纯度≥99.0%）、α-松油醇（纯度≥98%）均购于Aladdin 公司；β-法尼烯（纯度≥95%，Herbest公司）。

1.2 仪器分析条件

气相色谱条件：色谱柱组合为HP-5 MS（5%苯基-95%二甲基聚硅氧烷，30 m×0.25 mm×0.25 μm）以及DB-17 MS（50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷，1.0 m × 0.18 mm × 0.18 μm）；进样口温度为250 ℃；进样量为0.5 μL；分流比为20∶1；升温程序如下：50 ℃保持3 min，以4 ℃/min升至250 ℃并保持1 min；载气为氦气，恒流模式且保持流速为1.0 mL/min。

调制器条件：冷区温度为-50 ℃，进入热区和离开热区的温度相对于柱温为分别偏差+ 30 ℃和+120 ℃，两个热区的上限温度均为320 ℃；调制周期为4 s。

质谱条件：离子源为EI，电离能量为70 eV；离子源温度为200 ℃；四极杆温度为150 ℃；传输线温度为280 ℃；质量范围为m/z45～500；采集速率为50 Hz。

1.3 前处理方法

本文采用常规水蒸气蒸馏提取法［20］。将独活研磨成粉状过60 目筛后，称取30.000 g 粉末置于1 000 mL水蒸气蒸馏装置的蒸馏瓶中，并加入350 mL水和50 g NaCl，接上冷凝装置，加热至沸腾后开始计时3 h。样品提取完毕后，用无水硫酸钠干燥，转移至2 mL色谱瓶中待测。

1.4 数据处理方法

化合物定性鉴定通过与NIST 标准谱库（NIST/EPA/NIH 2017）进行匹配，选择正、反匹配因子均高于750 的化合物，同时使用保留指数和精确质量数对化合物作进一步确认［21-22］。根据峰面积归一化法进行半定量分析［23-25］。使用Mass Hunter（B.08.00，Agilent Technologies）软件进行1-DGC 数据处理；采用Canvas（V1.8.0，J＆X Technologies）软件进行GC×GC数据处理。

2 结果与讨论

2.1 全二维气相色谱分离

本文比较了1-DGC 和GC×GC 的色谱分离效果，其结果如图1 所示。在1-DGC 分析中共鉴定67 种化合物，而通过GC×GC可鉴定207种化合物（见表1），是1-DGC分离化合物数量的3.1倍。

表1 独活挥发油的化学成分鉴定Table 1 Chemical composition identification of Radix Angelicae Pubescentis essential oil

（续表1）

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此外，1-DGC分离存在严重的共洗脱现象，从图1选中的区域可看出，1-DGC仅检测到3个峰，分别为水芹醛、4-羟基-2-甲基苯乙酮、乙酸苄酯，而GC×GC 在相同保留时间处分离得到了6 个峰，新增加的3 个物质分别是3-甲基-4-异丙基苯酚、2-蒈烯-10-醛、对-甲基异丙基苯-7-醇。因此，从1-DGC和GC×GC 色谱图及检测数据对比可看出，GC×GC 分离可使得共流出峰有很好的改善效果，增加了峰的检测数量，从而进一步揭示独活挥发油的更多化合物组成，包括在1-DGC 分析中未发现的微量成分，同时获得更为准确的定性、定量效果。

图1 独活挥发油的1-DGC与GC×GC色谱图Fig.1 Chromatograms of Radix Angelicae Pubescentis essential oils by 1-DGC and GC×GC

为更好地显示独活挥发油化学成分在全二维气相色谱上的族类分离效果，根据化合物官能团不同进行分类，包括酸类、醇类、醛类、醚类、酯类、酮类、酚类、碳氢化合物及其他化合物。各类物质的全二维气相色谱族类分离效果如图2所示。

由图2 知，酸类、醛类和醚类物质在两个维度色谱柱上均能实现较好的族分离效果，其中酸类物质分布最为分散，在一维色谱上的保留时间从10 min 到46 min，而醛类物质的一维色谱保留时间大部分在30 min 内，主要与化合物的极性有关。酯类物质在两个色谱柱上的保留时间分布相对均匀，表明酯类物质的分子量和极性范围相对接近。其次，对碳氢化合物而言，它们主要由单萜（低分子）和倍半萜（高分子）组成，极性相对较弱，所以在二维色谱柱上的保留时间通常小于2.6 s，而苯酚类物质由于极性相对较高，所以在一维色谱柱上比较分散，且在二维色谱柱上的保留时间大于2.5 s。因此，本文所使用的色谱柱组合对独活挥发油具有较好的族分离效果。

图2 全二维气相色谱族分离效果Fig.2 Two-dimensional distribution of different chemical classes

2.2 定性分析

按照“1.4”方法进行定性分析，共鉴定了独活挥发油中的207 种化合物信息。首先基于NIST 库检索，筛选正向、反向匹配度均大于750 的化合物，然后通过分子离子峰的精确分子量，以及实测保留指数做进一步的化合物结构确认。根据所鉴定207 种化合物的匹配因子分布图（如图3），正向、反向匹配因子大于800 的化合物占90%以上，而且正向匹配度大于900的有16种，反向匹配度大于900的有40种化合物。因此，通过全二维气相色谱的二次分离，化合物质谱具有较好的匹配效果。

图3 化合物的匹配因子范围Fig.3 Match factor range for detected compounds

其次，利用分子离子峰信息对所鉴定的化合物进行定性分析，207 种化合物中有95.2%以上含有分子离子峰，但有少部分化合物由于在70 eV EI 电离条件下很容易碎裂，很难找到其分子离子峰信息［26］。比较了化合物分子离子峰精确质量数的实测值和理论值之间的误差，结果表明，存在分子离子峰的所有化合物质量偏差均在± 3 ppm 之内，符合利用高分辨精确质量数对化合物的定性要求［27］。因此，利用精确质量数的高分辨质谱可以进一步提高所鉴定化合物结构的可靠性。

此外，保留指数（RI）是化合物定性的最有效手段之一，通常要保证所鉴定化合物的实测值与文献值之间的差值在±40 之间［28］，而且保留指数的应用可进一步筛选和减少谱库检索提供的化合物数量，提高定性结果的准确度和可信度。按照“1.2”仪器分析条件，采用正构烷烃（C8～C25）对所鉴定化合物的保留指数进行实测，并与文献值相比较。结果显示，本文所鉴定化合物的实测保留指数值与文献值之间具有良好的一致性，所有差值均在可接受范围内（＜40），且80%以上物质的保留指数偏差在20 之内，进一步提高了化合物的定性准确性。

为进一步证实定性结果的准确性，本研究选取5 种标样对真实样品中的化合物进行对比验证（表2）。由表2可知，实测样品的一维与二维保留时间均与标准品的保留时间基本一致。其次，标准品与样品的保留指数偏差均在20之内，且精确质量偏差不超过1 ppm，证实了鉴定结果的可信度。

表2 5种标样质谱信息与真实样品的定性信息对比Table 2 The comparison of mass spectrum informations of selected standards and corresponding compounds in true samples

2.3 定量分析

采用“1.4”方法对所鉴定的207种独活挥发油成分进行半定量分析，其分类比较结果如图4所示。独活挥发油的各类物质含量大小依次为酯类（36.27%）＞醇类（15.68%）＞酚类（14.69%）＞碳氢化合物（13.60%）＞酮类（4.93%）＞酸类（2.45%）＞醚类（1.10%）＞醛类（0.77%），其他成分为3.39%。由此可看出，酯类、醇类、酚类、碳氢化合物是独活挥发油最丰富的化学成分，其中包括27种酯、63种碳氢化合物、41种醇及8种酚类。其次，欧芹酚甲醚的含量最高，相对含量为30.07%，其具有促分泌、驱虫、抗增殖等生物活性，与文献报道欧芹酚甲醚是独活中主要化合物的结论相符［29］。此外，α-没药醇（3.34%）、2-（二乙氨基苯基甲基）环己醇（2.87%），β-水芹烯（2.68%）和4-羟基-3-甲基苯乙酮（2.23%）等活性物质的相对含量也较高［30-32］，具有较好的药用价值。因此，本文的检测结果可提供独活挥发油最全最有用的物质信息，对于挖掘独活挥发油的物质基础和药用价值具有重要意义。

图4 独活挥发油化学成分的分类比较Fig.4 Comparison of Radix Angelicae Pubescentis essential oils chemical composition by different classes

3 结 论

为深入了解独活挥发油的物质基础以及药用价值，本文采用全二维气相色谱-四极杆飞行时间质谱对水蒸气蒸馏获得的独活挥发油成分进行高通量分析。利用全二维气相两根色谱柱的正交分离效果，更好地解决了常规一维色谱方法中峰共流出的问题，从而提高了色谱峰容量，实现了高通量分析。此外，结合四极杆飞行时间质谱的精确质量数以及保留指数进一步定性确认，提升了化合物定性的准确性。本文共检测到独活挥发油中207 种化学成分，是目前为止鉴定独活挥发油成分最多的分析方法。此外，化合物半定量分析表明，酯类、醇类、酚类和碳氢化合物是独活挥发油的主要化学成分。本研究为独活挥发油药用价值的开发利用提供了物质基础，也为其他挥发油化学成分的高通量分析提供了方法参考。