一种同时测定生鲜乳中7种巴比妥类药物的方法及其应用效果

杨晓君 梅博 韩奕奕

（上海市农产品质量安全中心，上海 201708）

巴比妥类药物（barbiturates）是一种安眠镇静药物，通常作为化学保定剂和镇静药物用于动物临床，可引起近似生理性睡眠，临床表现主要为抑制中枢神经系统（包括血管运动中枢和延脑呼吸中枢）[1]。但是，由于巴比妥类药物存在致癌、致畸等毒性作用，长时间食用带有其残留的动物制品，容易造成药物积累，严重危害人类健康。因此，许多国家和地区禁止将巴比妥类药物用于人和动物[2-3]。据文献报道，目前，分析巴比妥类药物的检测方法主要有气相色谱法、气相色谱质谱联用法、高效液相色谱法、高效液相色谱-质谱联用法等。其中，高效液相色谱-质谱联用法是目前巴比妥类药物检测的首选方法，其应用范围广泛。例如，张峰[4]等建立了超高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱快速检测方法，并对动物饲料中违禁添加的巴比妥类药物进行了测定，样品经甲醇提取、C18固相萃取柱净化后进行检测，3种化合物的检出限为0.20 mg/kg，回收率为62%～85%；田怀香[5]等采用高效液相色谱-串联质谱法检测了生鲜乳中4种巴比妥类药物残留，样品经乙腈提取、SPE柱净化后进行检测，4种药物残留的检出限为5 ng/g，回收率为85.0%～113.5%。

笔者分析已有的研究成果发现，国内外报道的巴比妥类药物检测方法大多是针对人的血液、尿、胃内容物和猪肉、猪肝中的药物残留及其代谢产物，目前，将此方法应用到生鲜乳中巴比妥类药物残留检测的研究较少。因此，建立一种生鲜乳中巴比妥类药物残留的检测方法，具有极其重要的意义，不仅能健全和完善相关的标准体系，还可规范原奶的生产技术，从而促进生鲜乳行业整体质量水平的提高。在此背景下，笔者研发了一种能快速、灵敏、特异性强地检测生鲜乳中7种巴比妥类药物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫喷妥）的方法，并对该方法所涉及的提取、净化、定性条件、定量条件等进行了优化，以期加强生鲜乳行业质量监控，切实保护奶农和消费者的利益。现将相关研究成果报道如下。

1 材料与方法

1.1 化学药品和试剂

化学药品和试剂包括：乙腈、甲醇（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司），超纯水（Milli-Q系统生产），PSA吸附剂（天津博纳艾杰尔科技有限公司），无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠（分析纯，德国M e r c k默克)，巴比妥（Barbital）、苯巴比妥（Phenobarbital）、戊巴比妥（Pentobarbitone）、异戊巴比妥（Amobarbital）、仲丁比妥（Butabarbital）、司可比妥（Secobarbital）、硫喷妥（Pentothal）的标准品纯度不低于95%（天津阿尔塔科技有限公司）。

标准贮备液制备：准确移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫喷妥的标准品各1.00 mL，分别用甲醇定容至10.00 mL，配制成浓度为10 μg/mL的标准贮备液，然后在2～8 ℃的环境下冷藏保存，有效期为3个月。

混合标准中间液制备：准确移取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫喷妥的贮备液各1 mL，用甲醇定容至10.00 mL，该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥、硫喷妥的浓度均为1 μg/mL，在2～8 ℃环境下冷藏保存，有效期为1个月。

1.2 仪器和条件

Agilent 6495 三重四极杆液质联用系统（美国Agilent公司），ZORBAX Eclipse Plus C18液相色谱柱（规格为150 mm×3.0 mm，粒径1.8 μm，美国Agilent公司）。

液相色谱条件：柱温为35 ℃；进样体积为5μL；流速为0.4 mL/min；A路流动相为水，B路流动相为乙腈，流速及梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序

质谱检测条件：离子源为电喷雾离子源（ESI）；毛细管电压为3.5 kV；喷嘴电压为500 V；干燥气温度为200 ℃；鞘气温度为250 ℃；扫描方式为负离子扫描；检测方法为多重反应监测（MRM）；干燥气流量为14 L/min；鞘气流量为11 L/min；雾化器工作压力为35 psi；定性离子对、定量离子对、碰撞能量加速电压参数均见表2。

表2 7种巴比妥类药物的质谱检测条件和保留时间

1.3 实验方法

经对检测方法所涉及的提取、净化、定性条件、定量条件等进行优化（优化结果见2.1），得到最终检测方法如下。

1.3.1 样品前处理

提取：准确称取生鲜乳样品10.00 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入乙腈20 mL，高速涡旋混匀20 min，然后加入6 g复合沉淀剂（无水硫酸镁、氯化钠、柠檬酸钠和柠檬酸氢二钠按质量比8∶2∶2∶1混合而成），立即涡旋混匀约30 s，于8 000 rpm条件下离心10 min，取上清液备用。

净化：吸取提取液约8 mL于已加入1 g复合吸附剂（无水硫酸镁、PSA按质量比6∶1混合而成）的15 mL塑料离心管中，涡旋混匀30 s后，于10 000 r/min条件下离心5 min。取上清液于eppendorf管内，用水定容至1 mL，充分混匀后经0.22 μm有机相滤膜过滤，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。

1.3.2 标准溶液的制备

将空白样品按样品提取步骤进行前处理，取巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、仲丁比妥、司可比妥、硫喷妥标准溶液,用空白样品提取液分别配成2、5、10、20、50、100 ng/mL的基质混合标准工作溶液，供上机测定。

1.3.3 数据分析

使用Excel软件对实验数据进行分析处理，显著性为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 检测方法优化

2.1.1 提取试剂优化

本实验比较了甲醇、乙酸乙酯、三氯甲烷、乙腈4种提取试剂的提取效果。结果发现，甲醇对蛋白的沉淀效果不好；乙酸乙酯和三氯甲烷虽能较好地提取极性较弱的巴比妥类药物，但是由于生鲜乳中的脂肪、蛋白、磷脂含量较高，导致提取过程中容易产生乳化现象；乙腈不仅能完全提取生鲜乳中的巴比妥类药物，还能起到较好的沉淀蛋白作用，且在酸性条件下，在乙腈溶液中再加入氯化钠、硫酸镁等沉淀剂，可通过增加水相比重，有效将巴比妥类药物全部转移到乙腈层。因此，本实验选择乙腈作为提取试剂。

2.1.2 固相吸附剂优化

本实验比较了不净化、活性炭净化、C18净化、普通净化的净化效果，4种固相吸附剂的组分见表3。结果发现，以普通的无水硫酸镁+PSA组合的净化效果最好，回收率最高，结果见图1。

表3 4种固相吸附剂组分比较

图1 不同净化方式的巴比妥类药物回收率

2.1.3 液相色谱柱的选择和洗脱程序优化

本实验比较了以甲醇-水和乙腈-水为流动相时7种巴比妥类药物的质谱响应。结果发现，以乙腈-水为流动相时，7种巴比妥类药物的质谱响应更好，故本实验采用乙腈作为流动相中的有机相。同时，本实验还比较了以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相时7种巴比妥类药物的离子对信号强度的影响，结果表明，当水相中加入0.1%甲酸时，仅有硫喷妥的离子对信号强度增强，其他6种巴比妥类药物的离子对信号强度均减弱，故最终本实验选择乙腈-水作为流动相进行试验。

巴比妥类药物残留检测中常用的色谱柱有C18和HSS PFP色谱柱，本实验以水-乙腈为流动相，比较了7种巴比妥类药物在两种色谱柱上的分离效果。结果发现，7种巴比妥类药物在C18柱上的峰形、响应信号明显优于HSS PFP色谱柱，见图2。故本实验选择C18液相色谱柱进行试验。同时，本实验还发现，柱温会影响待测物的保留时间和峰型，表现为柱温越高，出峰越快，保留时间越小，且峰型变窄，分离度增大。为满足检测条件，最终本实验选择柱温为35 ℃。

图2 7种巴比妥类药物总离子流图

2.2 方法验证

笔者对优化形成的同时检测生鲜乳中7种巴比妥类药物的高效液相色谱-串联质谱法的线性关系、准确度、精密度进行验证。

2.2.1 线性关系和检出限

在2～100 ng/mL浓度范围，7种巴比妥类药物的相关系数均大于0.995 0，表现出良好的线性关系。同时，在样品中添加最低检出限相当浓度的标样，以验证该方法的灵敏度，发现该方法对生乳中巴比妥类药物的检出限为10 μg/kg，方法灵敏度高，可用于痕量分析。具体结果见表4。

表4 线性关系、检出限、相关系数和浓度范围

2.2.2 准确度、精密度

在样品添加浓度为20～100 ng/mL时，巴比妥的回收率为81.2%～95.9%，苯巴比妥的回收率为81.9%～94.3%，仲丁比妥的回收率为88.6%～96.3%，戊巴比妥的回收率为93.2%～99.2%，异戊巴比妥的回收率为89.0%～99.5%，司可比妥的回收率为93.1%～98.2%，硫喷妥的回收率在79.9%～82.1%，表明该方法可实现较高的回收率，满足检测要求。见表5。

表5 7种巴比妥类药物残留的加标回收准确度实验结果

在样品添加浓度为20 ng/mL时进行重复性试验，巴比妥的变异系数为3.11%，苯巴比妥的变异系数为3.58%，仲丁比妥的变异系数为2.86%，戊巴比妥的变异系数为4.28%，异戊巴比妥的变异系数为3.07%，司可比妥的变异系数为4.41%，硫喷妥的变异系数为4.27%，表明该方法具有较好的重复性和稳定性。见表6。

表6 7种巴比妥类药物残留的加标回收精密度实验结果

根据方法学验证的要求，组织上海市食品研究所、上海市农业科学院农产品质量标准与检测技术研究所、上海海关动植物与食品检验检疫技术中心等单位对本方法进行验证试验，并对生鲜乳中7种巴比妥类药物的残留量进行再现性试验。结果表明，重复性变异系数在2.56%～4.55%，再现性变异系数在 2.87%～4.69%。

结合上海市农产品质量安全中心生鲜乳质量安全与日常保障项目，收集来自上海及其周边地区牧场的生鲜乳样品98批次，运用该方法进行7种巴比妥类药物残留的风险排查工作。经检测，98批次生鲜乳样品中均未检出巴比妥类药物残留，且试验过程中加标质控样的回收率在80.4%～95.6%。以上结果说明，上海及其周边地区的牧场在奶牛生产养殖过程中，严格遵守了国家相关法规，均没有违禁使用巴比妥类药物。

3 结论与讨论

笔者研发了一种能快速、灵敏、特异性强地检测生鲜乳中7种巴比妥类药物（巴比妥、苯巴比妥、戊巴比妥、异戊巴比妥、司可比妥、仲丁比妥和硫喷妥）的高效液相色谱-串联质谱法，该方法具有较好的灵敏度、选择性和稳定性，此方法检出限为10 μg/kg，回收率为79.9%～99.5%，回收率试验变异系数≤7.58%，重复性试验变异系数≤4.41%。同时，本方法采用QuEChERS前处理技术，相较于传统净化过柱方法，缩短了60%以上的操作时间，可做到批量测定。因此，该方法具有较好的应用前景。

值得注意的是，该方法中前处理样品的稀释倍数较高，因此宜适当降低稀释倍数，并提高上机液浓度，从而提高该方法的灵敏度，以适应更低浓度的精确定量要求。