油菜苗期耐盐碱性综合评价与根际土壤有机酸含量比较

吴鹏博 李立军 张艳丽

（内蒙古农业大学农学院，010018，内蒙古呼和浩特）

土壤盐碱化制约农业生产的发展，影响全球各大洲干旱地区100多个国家的9.55亿hm2农田，其中约有 37%的土地为碱性盐土[1-3]。世界三大盐碱土聚集区之一的松嫩平原是我国面积最大的碱性盐碱地，其面积有继续扩大的趋势[4-5]。土壤盐碱化类型为 NaHCO3或 Na2CO3等碱性盐比 NaCl或Na2SO4等中性盐对植物的伤害更大[6-8]，目前农业生态学家对中性盐的胁迫机制和原因给予了较多关注，而对碱性盐胁迫的关注较少。

油菜（Brassica napus L.）是我国发展盐碱农业的理想候选作物[9]。双低油菜对盐碱的耐受等级为中抗及以上[10]，油菜耐盐碱能力改良的起点较高，但不同油菜种质抗盐碱能力存在差异。在大豆[11]、棉花[12]和燕麦[13]等作物已有关于植物耐盐碱性鉴定及指标筛选的报道，而关于油菜耐盐碱性的研究较少。苗期被认为是大多数作物生长受盐碱胁迫影响最关键的时期[14]。因此，通过对不同油菜种质进行苗期碱性盐胁迫，综合评价其耐盐碱性，筛选耐盐碱性较强的油菜种质，对油菜耐盐碱品种的选育具有重要意义。

植物有机酸代谢调节在抵抗逆境胁迫时起关键作用。例如，植物可以通过根系分泌的有机酸对土壤进行金属解毒[15-17]，并可清除土壤中放射性污染物铀[18]。有机酸的积累是植物对高pH值环境的一种适应性表现，例如碱胁迫下沙棘[8]和星星草[19]等植物体内均可积累大量的有机酸，只是积累的有机酸种类不尽相同，其中主要包括草酸、柠檬酸、苹果酸和琥珀酸等。有研究[20]表明，有机酸可作为pH调节剂积累于细胞中，以补充土壤在高pH环境下根系分泌 H+及其他代谢产物对根外微环境调节的不足。也有研究发现，有些碱敏感植物[21]和低抗碱盐性植物[22]不会积累有机酸。根际土壤因化学和生物学性质最活跃而受到越来越多的重视[23]。本研究对碱性盐胁迫下油菜根际土壤有机酸含量的变化进行分析，探讨有机酸在油菜抗盐碱过程中的生理作用，为解读油菜对碱性盐胁迫的适应机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与土壤

8个供试油菜种质由华中农业大学提供，分别是华油杂62、青杂9号、崇2、17崇1、16-P32外、16-P22外、金油158和华双5号，分别编号为RA01、RA02、RA03、RA04、RA05、RA06、RA07和 RA08。选取其中对碱性盐抗性最强和最弱的2个油菜种质测定根际土壤有机酸含量。

试验土壤采自内蒙古农业大学新区农场，田间持水量为25.4%。土壤理化性质为pH 8.08、电导率91.0μS/cm、有机质8.92g/kg、全氮0.70g/kg、全磷0.54g/kg、全钾10.18g/kg、碱解氮59.61mg/kg、速效磷3.83mg/kg、速效钾98.3mg/kg。

1.2 试验设计

试验在内蒙古农业大学农学院温室进行，温室的昼夜温度为（25±2）℃和（20±2）℃，光照 14h/d，相对湿度 60%。采用盆栽方法，将 2种碱性盐NaHCO3和Na2CO3（分析纯）按摩尔比2:1混合，然后与土壤搅拌均匀后装入内径18.5cm、高23cm的花盆中。抗性指标筛选试验中，设置0（A0，对照）和 4g/kg（A4）2个碱性盐在土壤中的浓度处理，于2020年6月28日播种，8月3日取样，筛选碱性盐胁迫下耐性最强与最弱的油菜种质。

以筛选的耐性最强和最弱的种质为材料，设置4个土壤中混合碱性盐的浓度，分别是0（A0，对照）、2（A2）、4（A4）和 6g/kg（A6）。于 2020 年9月10日播种，10月15日取样。按照田间持水量达到90%计算每盆的浇水量，待达到适宜播种条件后播种。选取饱满均匀的油菜种子播种3盆，每盆6穴，每穴3粒，齐苗后间苗，保证每盆6株。生长指标和根际土壤有机酸含量的测定均3次重复，每个重复4株幼苗。处理后土壤pH和电导率见表1。

表1 处理后土壤pH和电导率Table 1 The pH and electrical conductivity in soil after treating

1.3 测定指标与方法

1.3.1 出苗率 播种后 7d统计出苗数。计算出苗率，出苗率（%）=（种子出苗数/供试种子总数）×100。

1.3.2 生长指标 取出植株，将植株清洗干净，用纸巾擦干后使用电子游标卡尺测定茎粗，用直尺测量株高和主根长，将植株分为地上部和地下部，称鲜重，然后在105℃杀青30min，再于80℃下烘干12h，称干重。

1.3.3 根际土壤有机酸含量 抖下根系附着的疏松土壤并用毛刷收集与根系紧密结合的土壤，称取10g土壤样品，加入0.1%磷酸水溶液100mL，振荡5min后在2000转/min下离心30min，之后过水相0.45μm滤膜，利用岛津LC-20AT高效液相色谱仪测定有机酸组分和含量。试验用的草酸、苹果酸、酒石酸、抗坏血酸、甲酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸标准品均为分析纯。流动相：0.01mol/L磷酸氢二铵，用1mol/L磷酸调pH至2.70，用0.45μm滤膜过滤，使用前用超声波脱气；流速0.8mL/min；分析柱为 XAqua-C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱温30℃；紫外检测波长 210nm，带宽 40nm；进样量20μL。

1.4 数据处理

采用Microsoft Office Excel（2010）对试验数据进行整理作图。利用IBM SPSS Statistics 20.0统计软件进行方差检验、相关性分析和主成分分析，同时采用隶属函数法对主成分分析中得分系数较高的指标进行耐盐碱性综合评价，参照桑晓慧等[12]的方法计算。IA=Di /Si，μ（d）=（IA-IAmin）/（IAmax-IAmin），IA为耐盐碱系数，μ（d）为隶属函数值，Di为碱性盐胁迫下的性状值，Si为无胁迫下的性状值，IAmin和IAmax分别为耐盐碱系数的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 碱性盐胁迫下油菜种质耐盐碱指标主成分分析

对8个油菜种质的8个生长指标进行主成分分析，通过确定具有代表性的指标来综合评价其耐盐碱能力。由表 2可知，2个主成分累计贡献率为91.179%，可以解释原8个变量的绝大部分信息，损失量仅为8.821%。第1主成分特征值为6.254，贡献率为78.181%，与第1主成分紧密相关的因子包括出苗率、植株鲜重、植株干重、根干重、株高和主根长，得分系数分别为0.152、0.157、0.155、0.156、0.152和0.144，可综合表现出碱性盐胁迫下油菜苗期的生物量积累和生长状况。第2主成分特征值为1.040，贡献率为12.998%，茎粗载荷最大，得分系数为0.954。因此，可将出苗率、植株鲜重、植株干重、根干重、株高、主根长和茎粗作为油菜抗碱性盐胁迫评价的特征因子。

表2 碱性盐胁迫下油菜种质各指标的主成分分析Table 2 Principal component analysis of various indexes of rapeseed germplasms under alkaline salt stress

2.2 油菜种质苗期指标的耐盐碱系数

由表3可知，在碱性盐胁迫下，8个油菜种质的出苗率、茎粗、植株鲜重、植株干重、根干重、株高和主根长的均值与对照相比均有所降低。各指标在种质间的变化和排序不同。

表3 8个油菜种质各指标的耐盐碱系数Table 3 Mixed saline-alkali tolerance coefficients of each indicator of eight rapeseed germplasms

2.3 碱性盐胁迫下油菜种质隶属函数及排序

根据主成分分析，从8个指标中筛选出贡献率较大的出苗率、茎粗、植株鲜重、植株干重、根干重、株高和主根长7项指标进行隶属函数分析，求平均值，对8个油菜种质进行耐盐碱性综合评价，从结果（表4）看出，华油杂62耐盐碱性最强，16-P32外最弱。耐盐碱性综合评价排序为华油杂62＞华双5号＞崇2＞16-P22外＞青杂9号＞金油158＞17崇1＞16-P32外。

表4 碱性盐胁迫下8个油菜种质隶属函数及排序Table 4 Membership function and ranking of eight rapeseed germplasms under alkaline salt stress

2.4 碱性盐胁迫对华油杂 62和 16-P32外苗期表型的影响

随着碱性盐浓度的增加，2个油菜种质生长速度减慢，植株弱小，其中华油杂62的表现好于16-P32外（图1）。

图1 不同浓度碱性盐胁迫下华油杂62和16-P32外的表型差异Fig.1 Differences in phenotypes of Huayouza 62 and 16-P32 wai under different alkaline salt concentrations

2.5 碱性盐胁迫对华油杂 62和 16-P32外苗期根际土壤有机酸含量的影响

华油杂62和16-P32外根际土壤各有机酸含量均受到碱性盐处理的显著影响，并且处理和种质差异对油菜根际土壤草酸、琥珀酸和酒石酸有显著的交互作用（表5）。2个油菜种质根际土壤中草酸、甲酸、柠檬酸和琥珀酸含量均有随碱性盐浓度增大而升高的趋势，各处理琥珀酸含量与A0均有显著差异，A4、A6处理柠檬酸含量与A0有显著差异，华油杂 62各处理甲酸含量与A0均有显著差异，16-P32外的甲酸含量仅A6处理较A0具有显著差异。草酸是碱性盐胁迫下2个油菜种质根际土壤中含量较多的有机酸，华油杂62和16-P32外在A6处理下的草酸含量分别占总有机酸含量的 59.34%和60.67%。华油杂62各处理的根际土壤草酸含量较A0分别显著增加67.08%、176.53%和1229.54%，16-P32外分别显著增加41.31%、55.74%和868.63%，表明高浓度碱性盐能强烈诱导2个油菜种质根际土壤草酸含量增加。华油杂62根际土壤草酸含量在A0和A2处理下低于16-P32外，但A4、A6较高浓度碱性盐处理下高于 16-P32外，甲酸含量仅在A6处理下低于16-P32外，柠檬酸和琥珀酸含量则是各处理均高于16-P32外。

表5 碱性盐胁迫下油菜根际土壤有机酸含量Table 5 Organic acid contents of rapeseed rhizosphere soil under alkaline salt stress μg/mL

由表5可知，2个油菜种质根际土壤中苹果酸、酒石酸、乙酸和抗坏血酸含量在不同浓度碱性盐胁迫下均表现出先升高再降低的趋势，其中苹果酸、酒石酸和抗坏血酸含量均在A4处理下达到峰值，华油杂62分别达到8.371、0.652和0.065μg/mL，较A0分别增加 87.44%、18.98%和 261.11%，16-P32外分别达到7.623、0.573、0.068μg/mL，较A0处理分别增加62.50%、42.89%和655.55%。乙酸含量在A2处理下达到峰值，华油杂62和16-P32外分别为0.734和0.475μg/mL，较A0分别增加61.32%和16.42%。抗坏血酸含量很低，华油杂62根际土壤苹果酸含量在A0处理下低于16-P-32外，在A2、A4和A6处理下均高于16-P32外；酒石酸含量仅在A6处理下低于16-P32外；乙酸含量则在各处理下均高于16-P32外。

3 讨论

3.1 碱性盐胁迫下油菜生长指标的变化

盐碱胁迫使作物生长速度减慢、抑制作物根系吸收水分，从而导致其形态发生变化，因此作物的生长指标可作为耐盐碱指标[24-26]。作物对盐碱的抗性受多种因素的影响，用单一指标不能准确反映和评价植物的耐盐碱能力。研究发现，株高、生物量和发芽率可作为玉米萌发期耐盐碱鉴定指标[27]；根长、生物量和株高可作为无芒雀麦苗期耐盐碱鉴定指标[13]。本研究中使用多个指标综合评价 8份油菜种质的耐盐碱能力，通过主成分分析筛选贡献率较大的指标，对其进行隶属函数分析来评价油菜种质耐盐碱性，与王婧泽等[28]的研究方法一致。

3.2 碱性盐胁迫下油菜苗期根际土壤有机酸含量的变化

有机酸是一类在线粒体三羧酸循环中产生的带有羧基的低分子化合物，其合成、积累、转运及分泌对逆境条件下植物适应环境调节方面具有重要作用[29]。研究[30]表明，当植物受到碱性盐胁迫时，植物会通过提高根部有机酸分泌量和质子分泌能力来维持体内pH稳定及离子平衡。本研究从8份油菜种质中筛选出对碱性盐耐性最强和最弱的2个油菜种质华油杂62和16-P32外，测定其根际土壤有机酸含量，发现草酸的积累量最高。有机酸中的草酸不仅可以通过络合作用来达到缓解铝胁迫的目的[31]，还可以改变盐碱土壤的理化性质，降低土壤 pH。通过浇灌草酸可以帮助盆栽葡萄缓解盐碱胁迫[32]。结合本研究中油菜根际土壤草酸的大量积累，推测浇灌草酸对油菜适应盐碱胁迫同样具有一定作用。高浓度碱性盐胁迫导致2个油菜种质根际土壤中草酸、甲酸、柠檬酸和琥珀酸4种有机酸含量较A0均显著提高，这可能是因为油菜根系分泌的草酸、甲酸、柠檬酸和琥珀酸可以平衡碱性盐胁迫下过多的阳离子，维持了植物pH稳定，苹果酸、酒石酸和乙酸含量随着碱性盐浓度的升高呈先升高后下降的趋势，说明低浓度碱性盐胁迫下油菜根系可以做出快速反应，通过分泌有机酸来应对高pH伤害，而高浓度碱性盐胁迫会伤害油菜根系，使根系的代谢能力大大降低，从而抑制有机酸的合成。根外pH的调节也受根系分泌有机酸的影响，本研究中随着碱性盐浓度的增加，酒石酸和乙酸含量骤然下降或许也有碱性盐抑制2个油菜种质根系分泌有机酸活力的原因。华油杂62根际土壤的草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸含量在高浓度碱性盐胁迫下高于 16-P32外，酒石酸和甲酸含量低于16-P32外，说明在碱性盐胁迫下，2个油菜种质根际土壤有机酸对于降低 pH伤害有不同的侧重，不同油菜种质对适应碱性盐胁迫有不同的生理表现。

星星草对碱胁迫特殊的生理反应是有机酸中柠檬酸的积累[19]；沙棘在碱胁迫下苹果酸和柠檬酸含量较低，乙酸含量有很大提高[8]。本试验中，2个油菜种质在高浓度碱性盐处理后以分泌草酸为主，故推测草酸可能在油菜响应盐碱胁迫方面起的作用更大。草酸为碱地肤[33]和碱蓬[34]在应对盐碱胁迫时体内主要的有机酸，表明有机酸代谢的调节在不同植物中可能发挥不同的作用。

在碱性盐胁迫下，多种有机酸和总有机酸含量上升，抗性强与抗性弱种质表现不同。有关有机酸的积累机制等有待于进一步研究。

4 结论

对主成分分析中得分系数较高的指标出苗率、茎粗、植株鲜重、植株干重、根干重、株高和主根长等采用隶属函数法进行耐盐碱性综合评价，排序为华油杂62＞华双5号＞崇2＞16-P22外＞青杂9号＞金油158＞17崇1＞16-P32外。碱性盐胁迫下油菜有机酸合成增加，以缓解碱性盐胁迫带来的pH伤害，在草酸、酒石酸、甲酸、苹果酸、抗坏血酸、乙酸、柠檬酸及琥珀酸8种有机酸中，草酸的积累量最高，而抗坏血酸的积累量很低。除酒石酸和乙酸含量在A6处理下较A0有所下降外，其余各有机酸含量均上升。高浓度碱性盐胁迫下华油杂62的草酸、苹果酸、柠檬酸、琥珀酸和乙酸含量高于16-P32外，酒石酸和甲酸含量低于16-P32外。分泌有机酸是油菜调节根外pH的重要途径，是油菜应对碱性盐胁迫的重要生理响应。