白及多糖提取工艺及抑菌活性检测*

罗玲丽，匡勇斌，喻 淅，张 滔，冯秋菊

(吉首大学药学院，湖南 吉首 416000)

白及(Bletillastriata)，又名连及草、雪如末、甘根，是兰科白及属多年生草本植物[1].味苦、甘、涩、性凉，有止血止痛的功效，常被作为一种止血药物在临床上推广使用[2].研究发现白及中富含大量的粘胶类物质，其主要成分是葡萄糖甘露聚糖，可溶于水形成比较粘稠的亲水胶液，而白及的止血作用正是与其含有的粘胶类成分有关[3].白及胶有特殊的黏度特性，其理化性质与阿拉伯胶类似，是一种低毒、安全的高分子聚合物，通过相关药物活性成分的研究和表征，发现白及多糖有多种药理作用，包括抗病毒[4]、抗菌[5-6]、抗氧化[7]和保湿[8]等功效.

目前，市场上的各种化妆品几乎全是“化学化妆品”，其主要原料或半成品基本上是高级脂肪酸族化合物.近年来，具有抗氧化、保湿、美白等功效的天然产物护肤制品所占有的消费市场正在逐步扩大.天然浸提物化妆品的配料中主要含有植物浸提物或天然配料，其中所含有的合成化学配料较少或含量极低，将天然药物活性成分加入到化妆品中，产品针对性强，性能较稳定，护肤效力持久，作用温和，刺激小，安全系数较高.植物成分提取方法简易便行，添加后制得的相应产品疗效显著且毒副作用小，因而在国内化妆品研发领域备受关注.现代研究较多探讨白及植物的化学成分及生物活性，有关该属植物民间传统护肤利用的报道较少.为了开发效果更好的药妆用品，本研究将提取武陵山区白及的有效活性成分，并将其添加于现代化妆品中，制成天然植物白及系列化妆品，如白及膏.

本研究对白及多糖的提取工艺和抑菌作用进行了初步探讨，为后续白及膏的制作奠定了一定的基础.依据相似相溶原理采用适宜的溶剂萃取白及中多糖，根据溶剂性质的不同，提取方法有热水浸提法[9]、酸提法[10]和碱提法[11]等.因为多糖是极性大分子化合物，不溶于有机溶剂[10]，因此本研究采用水提醇沉法来提取白及多糖.本研究对白及多糖水提条件进行正交优化设计研究，设置不同料液比、提取温度、提取时间，以多糖提取率为指标，确定不同因素条件下的最佳提取条件，将提取的白及多糖粗品按照一定配比制得白及膏，对白及膏进行抑菌性能检测，旨在为白及化妆品行业的综合开发利用提供参考依据，拓展中药白及的药用范围和开发利用价值.

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

材料：白及(购自药店，产自贵州)；试剂：浓硫酸、蒽酮、氯仿、Na2HPO4、KH2PO4、正丁醇、牛肉膏、蛋白胨等(所有试剂纯度均为分析纯).

仪器：旋转蒸发器(RE 2000A)；电子天平；电热鼓风干燥箱(BGZ-76)；万能粉碎机；医用离心机(L530)；真空干燥箱(BZF-50)；立式压力蒸汽灭菌器(YXQ-LS-50SII).

1.2 实验方法

1.2.1 白及原材料的预处理 将购买的白及饮片平铺于烘盘中，于60 ℃的热恒温鼓风干燥箱中干燥至恒重，使用中药粉碎机粉碎，过20目筛后装入密封袋备用.

1.2.2 白及多糖的提取 准确称取白及粉末3 g，置于锥形瓶中，加入75 mL蒸馏水，在80 ℃恒温水浴锅中恒温提取2.0 h，将得到的提取液过4层纱布，收集滤液，浓缩得到一定体积的水提物，向浓缩后的滤液中加入Sevage试剂(氯仿∶正丁醇体积比为5∶1)，滤液与Sevage试剂的体积比为5∶1，充分振荡摇匀，于高速离心机3 500 r/min下离心15 min，取上清液，加入与上清液同等体积的95%乙醇，充分搅拌后，密封，室温下醇沉2.0 h，抽滤，浓缩到一定体积后进行真空干燥，获得白及总多糖粗品，对其称重后暂存冰箱备用.

1.2.3 白及多糖的测定 参照张晓静[12]的方法，精密称取干燥的无水葡萄糖标准品配制成0.1 g/L的葡萄糖标准液，吸取标准液0.0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL于试管中，分别加水至2 mL，在冰水浴中加入0.2%蒽酮-浓硫酸溶液8.0 mL，置于沸水浴中反应10 min，取出置于冰水浴中10 min.以0.0 g/L葡萄糖标准溶液为空白对照，在620 nm波长条件下测定各溶液的吸光值Abs.以葡萄糖的浓度作为X轴，Abs值作为Y轴，绘制标准曲线，得回归方程Y=5.581 0X+0.026 4，R2=0.993.准确吸取2.0 mL白及总多糖溶液代替葡萄糖标准品溶液，并按照上述流程进行实验，重复3次，于620 nm波长下测定样品的吸光度，按照下列公式计算白及的总多糖提取率：

白及总多糖提取率W=(C×V/m)×100%.

其中：C为样品中多糖的质量浓度，g/L；V为样品的定容体积，mL；m为白及粉末干重，g.

1.2.4 单因素实验 按1.2.2节方法提取制备白及多糖粗品，以料液比1∶25(g∶mL)、提取温度80 ℃、提取时间2.0 h、体积分数95%乙醇为基础水平，依次考察白及总多糖提取工艺中料液比(1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g∶mL))，提取温度(50，60，70，80，90 ℃)，提取时间(2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 h)对提取率的影响(表1).在考察单一因素影响时，其他影响因素水平与基础水平保持一致，以白及总多糖提取率为指标，绘制各因素对白及多糖提取率的影响曲线图.

表1 白及总多糖提取单因素实验水平表

1.2.5 正交优化实验 以单因素实验结果为基础，考虑经济成本和操作等因素，选择料液比、提取温度和提取时间进行3因素3水平设计正交实验，因素水平表见表2.

表2 白及总多糖正交实验因素水平表

1.2.6 抑菌研究 将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌菌种接种于牛肉膏蛋白胨的斜面培养基中，在37 ℃的生化培养箱中培养24.0 h，用无菌生理盐水稀释制成菌悬液.用打孔器将吸水性较强的滤纸打成直径为6.0 mm的圆形滤纸片，烘干灭菌后分别浸泡于质量浓度为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05，0.33，0.66 g/mL的白及提取物中，浸泡时间为2.0 h，浸泡后再烘干备用.对照组则浸泡在无菌水中，其他处理条件同前.

抑菌实验操作如下：用移液器移取300 μL菌悬液于牛肉膏蛋白胨斜面培养基上，用三角形涂布器将菌悬液均匀涂于培养基上，用白及提取物浸泡处理过的滤纸贴于平板上，每个平板贴3片，其中1片为空白对照，放入37 ℃生化培养箱培养24.0 h后，取出测定抑菌圈直径，比较抑菌效果.每种细菌平行接种3个平板.

白及膏化妆品配方：参考马世宏等[13]工艺方法，对其进行改进，按照双氧水∶甘油∶丙二醇体积比为5∶3∶3的比例配置A相组分，二甲基硅油∶羊毛脂∶硬脂酸∶十六醇体积比为2∶3∶2∶2的比例配置B相组分，白及提取物∶去离子水体积比为3∶7的比例配置C相组分.将B相搅拌加热至85 ℃，保温20 min；A相与C相搅拌加热至45 ℃，将B相加入A相与C相混合液中，合并在乳化设备中乳化30 min，冷却至45 ℃，加入C相搅拌均匀后冷却至40 ℃出料，制得成品后取1 mg溶于1 mL无菌水中备用，进行抑菌测试，方法与白及多糖提取液测定方法相同.将药店购买的一夫百应抑菌膏作为阳性对照，同法测定其抑菌性.

表3 白及膏配方

2 结果

2.1 标准曲线

使用蒽酮-浓硫酸法测定白及提取物的总多糖，以葡萄糖溶液作为对照品绘制标准曲线，如图1所示.

图1 葡萄糖溶液的标准曲线Fig. 1 Glucose Standard Curve

2.2 单因素实验结果

2.2.1 料液比对白及多糖提取率的影响 如图2所示，在料液比为1∶20～1∶35(g∶mL)范围内，随着提取溶剂的体积不断增大，白及多糖提取率也不断增加，当料液比为1∶35(g∶mL)时，白及多糖提取率达到最大值17.09%，而继续增大料液比，白及多糖提取率呈现下降趋势，可能是由于在料液比为1∶35(g∶mL)时达到了白及多糖提取的最大饱和，因此本研究选择1∶35(g∶mL)作为最优料液比.

图2 料液比对白及多糖提取率的影响Fig. 2 Effect of Material to Liquid Ratio on Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.2.2 提取温度对白及多糖提取率的影响 如图3所示，温度从50 ℃升高到90 ℃，随着提取温度的不断升高，白及多糖提取率也逐渐增加，可能是因为温度的升高加剧了分子热运动和分子扩散运动，这有利于白及多糖的溶出，从而增加了白及多糖提取率.在80 ℃前后，白及多糖提取率的变化前者大于后者，可能是较高的温度对白及多糖产生了分解破坏作用，因而提取率的增加幅度有所降低.因此本研究选择80 ℃作为最优提取温度.

图3 提取温度对白及多糖提取率的影响Fig. 3 Effect of Temperature on Total Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.2.3 提取时间对白及多糖提取率的影响 如图4所示，提取时间从2 h延长至6 h，随着提取时间的延长，白及多糖提取率不断增加，可能是因为提取时间越长，越能够使白及多糖充分地溶解出来.白及多糖提取率在3 ～ 4 h的变化率大于4 ～ 5 h，考虑到实际情况，本研究选择4 h作为最优提取时间.

图4 提取时间对白及多糖提取率的影响Fig. 4 Effect of Time on Total Bletilla striata Polysaccharide Extraction Efficiency

2.3 正交优化实验结果

根据单因素实验的结果，选取表2中不同水平因素进行正交优化，对结果进行极差分析以此来确定最佳的提取条件.由表4中的极差分析数据结果可以看出来，极差R(B)>R(C)>R(A)，说明3个因素对白及多糖的提取影响大小依次为提取温度(B)、提取时间(C)、料液比(A)，其中提取温度对提取效果影响最为显著.根据正交设计系列实验可得，白及多糖的最佳提取条件为A2B1C2，即料液比1∶35(g∶mL)，提取温度80 ℃，提取时间4.0 h，在此提取条件下白及多糖得率为25.97%.

表4 白及总多糖正交实验结果

2.4 抑菌实验结果

采用滤纸片法测定白及多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用，设置不同质量浓度梯度白及多糖进行测试(质量浓度分别为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/mL)，测定样品及对照品的抑菌圈直径大小.由图5可知在该浓度梯度下抑菌圈均不明显，可知在上述浓度梯度范围内白及多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果不明显.

从左到右，白及多糖质量浓度依次为0.01，0.02，0.03，0.04，0.05 g/mL，A为对照品图5 不同质量浓度白及多糖的抑菌效果Fig. 5 Inhibitory Effect of Different Concentrations of Bletilla striata Polysaccharid

为进一步验证白及多糖的抑菌效果，选取市售的一夫百应抑菌膏作为阳性对照，增大白及多糖提取液浓度进行抑菌测试，同时对制备的白及膏也进行了抑菌测试.由表5、图6可知，当白及多糖提取液质量浓度增大至0.33 g/mL和0.66 g/mL时，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用明显增强.尤其是当质量浓度达到0.66 g/mL时，白及多糖提取液对大肠杆菌的抑菌效果优于一夫百应抑菌膏.与一夫百应抑菌膏相比，白及膏对大肠杆菌的抑菌效果良好，而对金黄色葡萄球菌的抑菌效果较差.

表5 不同样品的抑菌测试

A—无菌蒸馏水对照品；B—0.33 g/mL的白及多糖提取液；C—0.66 g/mL的白及多糖提取液；D—市售的一夫百应抑菌膏；E—白及膏.图6 不同质量浓度试剂对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制效果Fig. 6 Inhibitory Effect of Different Reagent Concentrations on Escherichia Coli and Staphylococcus Aureus

3 结论

本研究采用水提醇沉法提取白及多糖，设计单因素实验、正交优化实验确定白及多糖的最优提取工艺为料液比1∶35(g∶mL)，提取温度80 ℃，提取时间4.0 h，在此提取条件下，白及多糖提取得率为25.97%.当白及多糖质量浓度为0.33 g/mL时，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，当质量浓度提高至0.66 g/mL时，白及多糖提取液抑菌效果较强，对大肠杆菌的抑菌效果优于市售的一夫百应抑菌膏.本研究结果可为白及后期的抑菌研究提供理论依据，为进一步开发其相关抑菌性研究奠定基础.关于处方白及膏的制备，其抑菌效果虽低于市售抑菌膏，但也证实处方的白及抑菌性能存在进一步提高的空间，仍需进一步研究.