基于网络药理与分子对接研究百合行治疗认知障碍的机制*

刘 也，付传君，刘 娜，李先辉，刘细寒

(1. 吉首大学药学院，湖南 吉首 416000；2. 吉首大学医学院，湖南 吉首 416000)

随着全球老龄化的加剧，痴呆中的认知障碍逐渐成为对中、低收入国家经济、社会效益影响巨大的非传染性疾病之一.最新的世界阿尔茨海默病报告指出，2050年全球患阿尔茨海默病的人数预计从4 600万人增加至1.315亿人.阿尔茨海默病(Alzheimer's Disease，AD)是认知障碍中最常见的一种类型[1]，主要患病人群是45岁以上老年人.AD可分为早期、中期和后期，早期以轻度认知功能障碍为主要表现；中期出现多种认知功能障碍，程度加重；后期出现严重的认知障碍，并伴有精神行为症状以及人格改变等.AD的常见症状是记忆力减退，患者通常会出现计算能力下降、认知能力下降、思维判断能力下降、语言功能障碍、方向感缺失、生活被动、情绪变化、精神症状和行为改变，患者最终可能会逐渐丧失生活能力[2].

目前，临床上用于治疗AD的药物主要包括胆碱酶抑制剂(如多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏、石杉碱甲等)、抗氧化剂(如维生素E等)、脑代谢激活剂(如茴拉西坦、吡拉西坦等)、谷氨酸受体拮抗剂(如盐酸美金刚等)，但大部分药物只能改善AD的症状，减缓病程进展，目前尚未有研究发现可逆转AD疾病进程的药物.研究发现，百合花提取物具有抗AChE作用及抗氧化作用，这为抗阿尔茨海默病提供了新线索[3].

百合为百合科植物百合(Lilumbrownill)的肉质鳞茎，具有观赏、食用、药用价值.百合中除含有淀粉、蛋白质、脂肪及钙、磷、铁、维生素Bi、B2、C等常规营养元素外，还含有一些特殊成分，如豆甾醇、秋水仙碱等多种生物碱.中医认为，百合味甘微苦，性微寒，具有治疗情志不遂、虚烦惊悸、失眠多梦、精神恍惚等症状的作用[4].本研究主要通过网络药理学来研究百合化学成分是否能改善认知障碍的症状.

基于系统生物学理论的网络药理学是一门新兴学科，研究者可利用网络药理学分析生物网络，并从中筛选出比较感兴趣的节点，进而设计多靶点药物分子[5-6].当前网络药理学已被应用于复杂疾病的中医药研究，如癌症、AD等[6-7].目前AD的发病机制及治疗方法尚未完全被探明.现使用的药物大多只能改善AD症状，但存在一定副作用，无法根治AD.目前大多数研究只探索了百合花提取物对抗阿尔茨海默病的潜在治疗作用，还未探索百合对认知障碍的治疗功效。基于此，本研究拟采用网络药理学方法研究百合化学成分防治认知障碍的作用机理，初步探究其抗阿尔茨海默病的主要药效物质以及潜在的作用靶点、作用通路，以期为后续研究提供参考.

1 数据库及对应的网址或软件

本研究所使用的数据库及对应的网址或软件如表1所示．

表1 实验使用的数据库及对应的网址或软件

2 实验方法

2.1 构建数据库

2.1.1 构建百合化学成分相关靶点数据库 以“BAI HE”为关键词，在药理学数据库和分析平台(TCMSP)中，调节生物利用度(OB)不小于30%，类药性(DL)不小于0.18[6]，搜索百合的化学成分，筛选出口服利用度高的化学成分作为研究对象.然后在药品标准数据库中，选择人类(Homo sapiens)作为研究物种，预测得到相关的潜在作用靶点[6]，进而获取百合化学成分相关靶点数据库.最后将中药有效成分与中药潜在靶点整合得到百合化学成分及相关靶点数据库.

2.1.2 构建认知障碍相关靶点数据库 以认知障碍常用的英文表达方式“Cognitive impairment”为关键词，在人类基因数据库(GeneCards)、比较毒物基因数据库(CTD)、在线人类孟德尔遗传(OMIM)、药物遗传学和药物基因组学知识库(PharmGkb)与药物数据库(DrugBank)中搜索，获得与认知障碍相关的所有疾病靶点，删除多个数据库之间重复存在的基因，得到最核心的认知障碍相关基因，绘制Venn图.

2.1.3 构建“药物成分—疾病”交集靶点数据库 分别将2.1.1节构建得到的百合生物碱化学成分相关靶点数据库与认知障碍相关靶点数据库导入到Venny 2.1.0软件中，取两者交集，得到“药物成分—疾病”交集靶点数据库[6].

2.2 构建蛋白相互作用(PPI)网络

将2.1.3节构建得到的交集靶点导入String数据库，选取人类(Homo sapiens)为研究物种，设置置信度为0.471，以确保数据的可靠性，保存相应结果.对PPI网络进行拓扑分析，并按degree值分布排列.绘制PPI网络图，根据拓扑分析结果筛选核心靶点，结合TCMSP数据库获取的成分靶点数据，Excel统计核心靶点关联成分，筛选得到核心成分[8].在Cytoscape 3.7.2软件中导入node1、node2和结合分数(Combinedscore)等信息，构建蛋白相互作用网络[6].

2.3 功能与通路富集

基于DAVID和Metascape富集分析工具，选定物种为“人”(Homo sapiens)，进行GO功能富集分析以及KEGG通路富集分析[8].

2.4 构建“药物成分—交集靶点—作用通路”网络

将百合成分进行编号，成分对应靶点，核心靶点对应通路，构建网络文件属性文件[8]，打开DAVID数据库，选择6.7版本，将2.1.3节得到的交集靶点导入DAVID数据库中，选择Identifier为Office gene symbol，选择List Type为Gene list，选取人类(Homo sapiens)为研究物种，选择Pathways下的KEGG_PATHWAY进行KEGG分析，设置阈值P<0.05，筛选排名靠前的通路，利用Omishare Tools对结果进行可视化处理[6].

2.5 分子对接

在化学数据库(PubChem)与蛋白质数据库(RCSB-Pdb)中检索核心成分靶点与配体文件，使用Autodock Vina软件对百合的核心成分与疾病预测的靶点进行分子对接[8].

3 实验结果

3.1 构建“药物成分—疾病”交集靶点数据库

3.1.1 构建百合化学成分相关靶点数据库 将筛选且去重后得到的百合中7种化学成分(表2)导入药品标准数据库中，选择人类(Homo sapiens)作为研究物种，预测得到相关的潜在作用靶点465个.将7种化学成分的相关潜在作用靶点合并，去掉重复的靶点后最终得到71个百合化学成分相关潜在作用靶点.通过对“7种活性化合物—化合物靶标”网络的总体特征进行分析(图1)，本研究发现7种活性成分不但存在一个化合物和多个靶蛋白结合的现象，而且存在多个化合物和同一个靶蛋白相互作用的现象，表明百合抗认知障碍存在多活性成分和多靶标作用特点.

表2 百合中药有效成分

图1 活性化合物—化合物靶标网络Fig. 1 Active Compounds - Targets Network

3.1.2 构建认知障碍相关靶点数据库 以认知障碍常用的英文表达方式“Cognitive impairment”为关键词，在GeneCards等数据库中搜索，查找与认知障碍相关的基因.在TCMSP数据库中获得百合预测作用靶点87个；在TTD，GeneCards，OMIM，DrugBank，PharmGkb数据库中获得认知障碍相关靶点共9 966个，去除5个数据库中重复的靶点后，TTD数据库中存在35个靶点，GeneCards数据库中存在9 831个靶点，OMIM数据库中存在16个靶点，DrugBank数据库中存在94个靶点，PharmGkb数据库中存在97个靶点.最后去除交集后，得到9 965个共同靶点，Venn图见图2.

图2 疾病靶点交集Venn图Fig. 2 Venn Diagram of Disease Target Intersection

3.1.3 构建“药物成分—疾病”交集靶点数据库 取3.1.1节的百合生物碱化学成分相关靶点数据库与3.1.2节的认知障碍相关靶点数据库二者交集，获得“药物成分—疾病”交集靶点数据库(图3).研究发现，认知障碍相关靶点(9 965个靶点)与7种药物成分相关靶点(71个靶点)之间共有44个交集靶点.

图3 药物成分—疾病靶点Venn图Fig. 3 Venn Diagram of Medicinal Ingredient-Disease Target

3.2 构建蛋白相互作用(PPI)网络

将44个“药物成分—疾病”交集靶点输入到String数据库中，点击多蛋白(Multiple proteins)，选取物种为人类(Homo sapiens)，筛选置信区间大于0.4的靶点，删除无连线的点(点击hide disconnected nodes in the network)，获得由42个“药物成分—疾病”交集靶点之间的蛋白相互作用信息构建的PPI网络图(图4)，然后把PPI网络图导入Cytoscape 3.7.2软件中，按照重要性排列，按照节点度值(Degree)排序，重新构建核心靶点互作网络，最后筛选得到10个核心靶点，分别是MAOB(单胺氧化酶B)，SLC6A3(多巴胺转运蛋白基因)，CASP3(半胱天冬氨酸蛋白酶3)，PTGS2(环氧合酶-2)，AR(肾上腺素能受体)，PGR(类固醇受体基因)，CASP8(天冬氨酸蛋白水解酶8)，JUN(1号染色体的基因)，ESR1(雌激素受体)和CASP9(天冬氨酸蛋白水解酶9)，见图5.

图4 药物成分—疾病交集靶点的PPI网络图Fig. 4 PPI Network Diagram of Medicinal Ingredients-Disease Intersection Targets

图5 核心靶点互作网络图Fig. 5 Network Diagram of Core Target Interaction

3.3 功能与通路富集

统计生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞成分(CC)的GO富集分析结果，分别取GO富集结果中排名前10者，绘制GO功能富集分析组图(横坐标为富集的数目，纵坐标为富集的GO名称)，颜色越红代表富集的显著性越高，长度越长代表相关基因越多，结果见图6、表3.由此可知，百合治疗认知障碍主要涉及的生物过程有腺苷酸环化酶-调制G蛋白偶联受体信号通路、腺苷酸环化酶-激活肾上腺素能受体信号通路、对外来刺激的反应、管径调节等；分子功能主要涉及调节G蛋白偶联胺受体活性、突触后神经递质受体活动、G蛋白偶联的神经递质受体活性、神经递质受体的活动等；细胞成分主要包括突触后膜、脑突触体膜、膜筏、膜微结构域等.

图6 GO功能富集分析组图Fig. 6 Group Diagram of Go Function Enrichment Analysis

表3 GO功能富集结果

由KEGG通路富集分析可得，认知障碍疾病主要涉及的通路包括神经活性配体-受体介导相互作用，神经退行性变的多种疾病，钙信号途径等，富集分析结果取前30，通路气泡富集图见图7，气泡大小代表通路上富集的基因数量，气泡越大，表明富集的基因数目越多；气泡颜色代表LogP值，其值由大到小从红色到蓝色变化[8].

图7 KEGG富集分析图Fig. 7 KEGG Enrichment Analysis Diagram

3.4 分子对接验证

将核心成分与核心靶点进行分子对接，当结合键能低于-5 kcal/mol时，表明活性成分与作用靶点对接结果良好，核心成分与核心靶点对接的结合最小自由能如表4所示，由于结合的最小自由能大于-10 kcal/mol才能稳定对接，所以最终筛选出可以发生对接的化学成分仅4种(图8)，其中豆甾醇与MAOB的分子对接模型见图9.

表4 基因与有效成分对接的结合最小自由能

图8 对接的百合化学成分Fig. 8 Chemical Composition of Lily Docking

图9 豆甾醇—MAOB蛋白结合模型Fig. 9 Stigmasterol-MAOB Protein Binding Model

4 讨论

经过几千年的临床实践，中医中药被证实了在治病、防病、养生上都有效可行.传统上，大多数新药的发现都集中在识别或设计与单个靶标特异性相互作用的药物上，但是，作用于单个分子靶标的药物通常在治疗某些疾病(例如糖尿病，炎症和癌症)时效果不佳[6,9].当前药物研究与开发已逐渐从“单一目标，单一药物”模式转变为“网络目标，多成分治疗”模式，网络药理学方法已用于研究“蛋白/基因—疾病”途径，该途径能够从网络角度描述生物系统、药物和疾病之间的复杂性，具有与中医相似的整体哲学观念[6-7,10].中医网络药理学是基于网络药理学来研究中药化学成分防治人体疾病作用机制的一种新的研究范式，旨在将中医药从基于经验的医学转变为基于证据的医学[6].

本研究利用网络药理学对百合化学成分干预认知障碍的作用机制进行研讨，以期发现百合中的活性成分及其潜在的抗认知障碍作用靶点及作用通路.本研究筛选得到百合的7种主要活性成分，并预测得到药物化学成分的潜在作用靶点71个，71个潜在作用靶点中，与认知障碍相关的交集靶点共44个，即“药物成分—疾病”交集靶点.此外，本研究发现，百合的7种主要活性成分与10个认知障碍关键核心靶标相关，并参与多种关键信号通路.进一步分析发现，百合的7种主要活性成分最有可能通过腺苷酸环化酶-调制G蛋白偶联受体信号通路发挥抗认知障碍作用.该通路是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体配体的集合[11]，涉及神经元乙酰胆碱受体(CHRNA1，CHRNA2，CHRNA3，CHRNA7)、肾上腺素能受体(ADRA1D，ADRA1A)、血清素受体(HTR2A，HTRlB)、多巴胺受体(DRD5，DRD1)等多种配体-受体信号转导途径，这些受体与人体的生理节律、内分泌、心血管控制、情绪、学习和记忆等功能有关.研究表明，CHRNA7其异常程度与认知功能相关[6,12]；DRD5属于G蛋白偶联受体超家族成员，可能参与奖赏和强化机制、认知和情感以及运动的调节，这与认知障碍的发生、发展密切相关[6].除了上述通路以外，百合的7种主要药效成分还可以通过腺苷酸环化酶-激活肾上腺素能受体信号通路、肾上腺素能受体信号通路、磷脂酶C-活化G蛋白-偶联受体信号通路等发挥药效作用.从构建的“药物成分—交集靶点—作用通路”网络的总体特征分析，百合化学成分抗认知障碍存在多活性成分、多靶标、多通路发挥作用的特点.通过构建蛋白相互作用(PPI)网络，本研究筛选得到10种百合药效成分抗认知障碍作用的关键靶点蛋白，分别是MAOB，SLC6A3，CASP3，PTGS2，AR，PGR，CASP8，JUN，ESR1，CASP9.其中MAOB是一种线粒体膜结合酶，主要分布于神经元和胶质细胞中，在多巴胺分解代谢过程中起到关键作用.MAOB在将羟化的多巴胺分解为高香草酸的同时，伴有氧自由基的生成，而产生的氧自由基会对神经细胞产生毒性作用.此外，MAOB还能活化神经毒性物质1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)，形成MPP+，MPP+是一种能诱导帕金森病的化学物质[13].因此，在帕金森病早期，使用抑制MAOB的药物(如司来吉兰)可减缓其疾病发展.帕金森病最大的病症是认知障碍，位于x染色体上编码MAOB的基因是目前研究较多的一个帕金森病的易感基因[13]，因此可以得知MAOB与认知障碍的产生密不可分.MAOB抑制剂可防止MAOB活化神经毒性物质MPTP，从而减缓认知障碍进展.本研究分析“药物成分—交集靶点—作用通路”网络模型发现，MAOB仅可与百合的Stigmasterol(豆甾醇)产生相互作用，说明百合的化学成分豆甾醇可能是一种新的类固醇药物，可用于治疗神经功能障碍.

综上所述，百合的核心成分为豆甾醇，通过作用于核心靶点MAOB，参与调控神经活性配体-受体介导相互作用、神经退行性变的多种疾病、钙信号途径，多途径共同发挥作用，防止MAOB活化神经毒性物质MPTP，减缓认知障碍的病情发展，帮助治疗认知障碍.

5 结语

基于网络药理学与分子对接的分析结果，本研究探讨了“化学成分—自由基氧化—认知障碍”之间的关系，提示百合可能通过防止MAOB活化神经毒性物质MPTP的方式对认知障碍起到一定的治疗作用.本研究借助网络药理学与分子对接的方法初步探讨了百合治疗认知障碍的机制，研究结果仍有不足之处，待于后续药理实验的进一步验证.