黄花蒿凝血药效部位及化学组分分析*

赵发法，张晓蓉

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院，湖南 吉首 416000；2.吉首大学药学院，湖南 吉首 416000)

中草药应用于治疗出血、失血历史悠久，已有文献报道多达300余种[1-4].中草药中多种化学成分具有止血活性，如糖类、生物碱类、萜类、黄酮类、鞣质、醌类化合物、香豆素类、脂类、有机酸类、氨基酸类等，这些化学成分是中药止血药效的物质基础[5-8].

黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)是我国宝贵的民间中药，具有止血、杀虫，治疗皮肤疥癣、蜂毒、蛇咬伤、烫伤，以及清热解暑、除蒸、截疟等药用功效[9]，作用广泛.近年来，黄花蒿的药效成分分析及开发利用取得较大进展.黄花蒿挥发油(精油)，主要包括单萜、倍半萜、单萜氧化物等[10-12]，具有杀菌、消炎、抗病毒、杀灭农业害虫等药效.倍半萜化合物青蒿素已成功开发为抗疟特效药，临床使用十分广泛.作为主要的功能成分，青蒿精油应用于香皂、沐浴露、洗头膏、蚊香等日化产品也已有报道[13-14].黄酮类化合物具有消炎、抗病毒、抗过敏、抗氧化、降尿酸、止咳、祛痰、促进人体激素分泌、抗糖尿病等药效[15].蒿类植物民间用于止血历史悠久.目前，用青蒿植物提取物制作的外用止血药“复方青蒿喷雾剂”(国药准字Z20025887)，已有市售.隋婧等[16]研究发现，青蒿75%乙醇粗提物经石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、水等溶剂萃取后，正丁醇萃取部分体外凝血效果显著，具有凝血时间缩短率高、对凝血时间敏感、血浆凝固较快等特点.基于黄花蒿凝血药效的民间应用，笔者拟对黄花蒿凝血药效物质基础进行研究，以揭示其凝血机理并为凝血新药的开发提供参考.

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄花蒿植物，采于吉首市郊；云南白药、鲜鸡血，均为市售.

1.2 仪器与试剂

60-UV-Vis型紫外可见分光光度计(安捷伦科技有限公司)，凝血陶瓷板.无水CaCl2，NaCl，枸橼酸钠，卵磷脂，正丁醇，无水乙醇，三氯甲烷，乙酸乙酯，石油醚，四氢硼钠，乙酸铅，以上试剂均为分析纯(AR).

1.3 实验方法

1.3.1 凝血活性部位提取 取黄花蒿粗粉各200.0 g，分别用正丁醇、体积分数70.0%的乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚提取4次，固液比1∶20，辅助超声提取时间10.0 min，合并提取液，过滤，减压蒸馏，收集浸膏，挥干溶剂，备用.

1.3.2 体外凝血实验 5种黄花蒿提取物浸膏以蒸馏水溶解，配置成质量浓度为0.01 g/mL的溶液，石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取液浓缩浸膏加入质量浓度为0.02 g/L卵磷脂辅助溶解.云南白药粉用蒸馏水溶解，过滤，作为体外凝血实验的阳性对照；以蒸馏水、等质量浓度的卵磷脂水溶液为阴性对照.采用凝血板法、试管法以及血浆复钙时间测定法进行体外凝血时间的测定.

1.3.3 黄酮化合物分离 取10.0 g黄花蒿正丁醇提取浸膏，以pH值为11.0的NaOH溶液250.0 mL(料液比1∶25)，超声溶解，抽滤.滤液加体积分数为10.0%的盐酸，调pH值为3.0，低温沉淀4 h，收集沉淀，余液再调pH值为3.0，继续低温沉淀4 h，合并沉淀，用正丁醇溶解沉淀，备用.

1.3.4 黄酮化合物理化分析 (1)紫外—可见光谱分析.测定黄酮分离样品的正丁醇溶液紫外吸收光谱，收集200～500 nm的光谱吸收值.

(2)荧光显色分析.黄酮粗纯化物采用薄层色谱法(TLC)分析，2次展层.第1次展层剂石油醚∶三氯甲烷∶甲醇∶氨水体积比8∶2∶1∶0.15；挥干展层溶剂后，再进行第2次展层，第2次展层剂三氯甲烷∶甲醇∶氨水体积比8∶2∶0.15.于365 nm波长观察斑点荧光.

(3)显色反应.盐酸—镁粉反应：样品溶液加入少许镁粉，摇匀，滴加浓盐酸几滴，颜色呈黄色、紫红色为阳性反应，否则为阴性反应.

四氢硼钠反应：样品溶液加入体积分数为2.0%的四氢硼钠甲醇溶液1.0 mL，1 min后，滴加几滴浓盐酸，颜色呈紫红至红色为阳性反应，否则为阴性反应.

乙酸铅反应：样品溶液加入体积分数为1.0%的中性乙酸铅水溶液1.0 mL，产生黄色至红色沉淀为阳性反应，否则为阴性反应.

浓盐酸反应：样品溶液滴加几滴浓盐酸溶液，出现黄色或橙色为阳性结果，否则为阴性反应.

1.3.5 萜类化合物分离 (1)正丁醇浸提物中萜类化合物分离.取黄花蒿植物粉末10.0 g，正丁醇过夜浸提，固液比1∶20(g∶mL)，辅助超声1.0 h.滤液-20 ℃放置过夜，过滤收集浮质，少量蒸馏水洗涤，少量正丁醇溶解，备用.

(2)黄花蒿植物精油制备.取黄花蒿叶200.0 g，装入圆底烧瓶，5倍量蒸馏水浸润，连续蒸馏3～4 h，收集上层液，即为黄花蒿精油，备用.

1.3.6 TLC法分析萜类化合物

采用TLC法分析两种方法制备的萜类化合物，展层剂石油醚∶乙酸乙酯(体积比9∶3)，显色剂为香草醛、磷钼酸，对TLC板进行显色分析.

2 结果与讨论

2.1 黄花蒿凝血活性部位筛选

采用凝血板法、试管法和血浆复钙时间测定法比较正丁醇、体积分数70.0%乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、石油醚5种溶剂对黄花蒿凝血活性物质浸提物体外凝血效果，结果如图1所示.由图1可知：

不同小写字母表示黄花蒿不同溶剂提取物体外凝血时间差异显著(P<0.01).图1 黄花蒿凝血活性部位分析Fig. 1 Analysis of the pharmacodynamics substance in Artemisia annua L.

正丁醇提取物凝血时间最短，凝血板的凝血时间为360.7 s，较蒸馏水和云南白药的凝血时间分别缩短了287.7 s(约44.37%)和187.0s(约34.14%)；试管法的凝血时间为58.3 s，较蒸馏水和云南白药的凝血时间分别缩短了28.7 s(约32.9%)和13.4 s(约18.6%)；血浆复钙时间测定法的血浆复钙时间为101.7 s，较蒸馏水和云南白药的凝血时间分别缩短了125 s(约55.14%)和65 s(约39%).可见5种溶剂提取物中，正丁醇提取物具有最显著的体外凝血效果.

体积分数70%乙醇提取物也具有较好的凝血效果，其凝血板的凝血时间为426 s，较蒸馏水和云南白药的凝血时间分别缩短了222.3 s和121.7 s；试管法的凝血时间为66.7 s，较蒸馏水和云南白药的凝血时间分别缩短了20.3 s和5 s；血浆复钙时间测定法的血浆复钙时间为139 s，较蒸馏水和云南白药的血浆复钙时间分别缩短了87.7 s和27.7 s.

石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取物均无凝血效果，其凝血时间与阴性对照几乎无差异.由于石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯提取物不溶于水，实验以不同质量浓度的卵磷脂为助溶剂，当卵磷脂质量浓度为0.020～ 0.025 g/L时，对凝血作用影响较小，因此凝血实验均采用质量浓度为0.020 g/L的卵磷脂作为助溶剂.

综上所述，正丁醇提取物凝血效果最显著，因此推测黄花蒿凝血活性部位为正丁醇提取物，该结果与文献报道结果相符.本实验将选用正丁醇作为凝血活性成分提取溶剂.

2.2 凝血成像

凝血板法、试管法和血浆复钙时间测定法检测黄花蒿正丁醇提取凝血活性物质的体外凝血成像如图2所示.图2(a)为凝血板法成像，其中1号为自然凝血(未凝)，2号为加入黄花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，血液呈现凝固现象，用大头针可推动凝血块.图2(b)为试管法实验成像，其中1号试管为自然凝血(未凝)，2号试管中加入黄花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，倾倒试管，血块凝固于管底.图2(c)为血浆复钙时间测定法成像，其中1号试管未出现白色纤维蛋白丝(对照组)，2号试管抗凝血浆加入黄花蒿正丁醇提取物浸膏水溶液后，可见弥漫性白色纤维蛋白丝，出现凝血现象.由此可知，黄花蒿的正丁醇提取物具有良好的凝血效果，为黄花蒿的凝血活性部位.

(a)(b):1—未凝固血;2—凝固血;(c):1—凝血浆;2—弥漫性白色纤维蛋白丝凝固血浆.图2 黄花蒿正丁醇提取物体外凝血成像Fig. 2 Coagulation Imaging of the Butyl Alcohol Extract in vitro

2.3 黄酮化合物分析

2.3.1 光学活性分析 以碱溶酸沉淀法分离正丁醇浸提物中黄酮化合物，光谱活性检测如图3所示.图3(a)为碱溶酸沉淀分离的黄酮化合物的紫外可见光谱，在330 nm处有明显吸收峰，在250 nm及268 nm处有微弱峰，沉淀收集后余液无吸收峰.图3(b)为黄酮粗纯化物的TLC荧光显色分析结果.黄酮粗纯化物存在8个荧光斑点，余液有4个微弱的斑点.由此可见，正丁醇浸提物存在大量黄酮化合物，碱溶酸沉淀法可较为完全地分离浸提物中黄酮化合物，正丁醇浸提物中至少含有8个黄酮化合物组分.

图3 黄酮化合物紫外可见光谱及TLC荧光成像Fig. 3 Ultraviolet-Visible Spectroscopy and Fluorescence Imaging of the Flavone Compounds by TLC

2.3.2 显色反应鉴定 对正丁醇浸提物分离的黄酮化合物进行还原反应、络合反应以及酸碱显色反应鉴定.由表1及图4结果可知，黄酮粗分离化合物盐酸—镁粉、四氢硼钠、浓盐酸、乙酸铅的显色反应均为阳性反应，沉淀分离后，余液显色未见变化，均为阴性反应.沉淀物为黄酮类化合物，余液几乎不含或仅含微量黄酮化合物.由显色反应进一步推测，分离物含有大量黄酮化合物，并具有黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮等化学结构.

表1 黄酮类化合物显色反应结果

图4 黄酮化合物显色反应成像Fig. 4 Imaging of the Color Reaction of the Flavone Compounds

2.4 萜类化合物分析

采用TLC法分析了低温法分离的正丁醇提取物中萜类化合物以及水蒸汽蒸馏法提取的植物挥发油中萜类化合物.香草醛和磷钼酸显色结果如图5所示.图5(a)为低温法分离的正丁醇提取物中萜类化合物，香草醛显色有红色与蓝色共5个斑点，磷钼酸显色可见6个蓝色斑点.图5(b)为水蒸汽蒸馏法提取的萜类化合物，磷钼酸显色可见7个蓝色斑点.由此可见，黄花蒿的正丁醇提取物中至少存在5种萜类化合物.

图5 萜类化合物的TLC分析Fig. 5 TLC Analysis of the Terpenoids Compounds in the Butyl Alcohol Extract

3 结语

黄花蒿植物在民间用于凝血，历史悠久，药效显著.本研究采用溶剂法对黄花蒿凝血药效物质进行研究，发现黄花蒿凝血药效活性部位为正丁醇提取物，实验结果与文献报道一致[16].本研究中，凝血板法、试管法、血浆复钙时间测定法3种体外凝血方法测定结果表明，正丁醇提取物体外凝血药效与自然凝血比较效率分别提高了44.37%，32.9%，55.14%，与云南白药凝血效果比较，药效分别提高了34.14%，18.6%，39%，凝血效果显著.

对黄花蒿植物正丁醇浸提物化学组分分析表明，提取物中含有大量黄酮类化合物.采用碱溶酸沉淀法分离正丁醇浸提物，分离物具有黄酮化合物典型的荧光特征.紫外光谱扫描分析可见330 nm处吸收峰以及250，268 nm处微弱峰等黄酮特征吸收峰.TLC分析显示，黄花蒿正丁醇浸提物中至少含有8个黄酮化合物组分.通过对分离物进行还原反应、络合反应以及酸碱显色反应实验，发现盐酸-镁粉、四氢硼钠、浓盐酸、乙酸铅与样品溶液反应均为阳性反应，可推断分离的黄酮化合物具有黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮等化学结构.此外，采用低温法从正丁醇浸提物中分离得到萜类化合物，采用香草醛和磷钼酸显色分析分离物的TLC展层结果，可见明显的萜类化合物斑点，与植物精油中萜类显色一致.

此外，笔者对已有文献报道的药用植物中发现的凝血活性化学组分[17-19]，如生物碱、多糖、甾体类化合物等组分也进行了检测，发现黄花蒿植物含微量的生物碱类物质，几乎不含可溶性糖类物质以及甾体类化合物，正丁醇浸提物检测不到此3类化合物.有关黄酮化合物及萜类化合物的凝血药效研究，笔者将另文报道.