基于磁性共价有机骨架对烤肉中苯并[a]芘的检测

2022-02-17杨念慈庞月红

食品与生物技术学报 2022年1期

杨念慈，杨成，庞月红

（江南大学食品学院，江苏无锡 214122）

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一类具有多个稠环的持久性有机污染物[1]，大多具有“三致效应”，即致癌性、致畸性和致突变性[2-4]。食物经过不适当的烹调方式如熏制、油炸和烧烤等，都会产生大量PAHs[5]，通过食物摄入对人体健康造成威胁[6]。苯并[a]芘（Benzo[a]pyrene，BaP）作为PAHs中致癌性最强的一种，已被国际癌症研究机构列为Ⅰ级致癌物[7]。BaP在环境中相对稳定、难以降解，含量又与PAHs总量相关，所以常用作评估多环芳烃暴露总量的指示物。我国在《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762—2017）中对肉及肉制品（熏、烤、烤肉）中BaP的最大限量为5.0 μg/kg[8]。

常用的BaP检测方法是将样品提取后，使用中性氧化铝柱或分子印迹固相萃取柱净化，高效液相色谱仪进行定性定量分析。然而传统的柱层析法和固相萃取法存在易堵塞、高背压和解吸不完全等问题，且成本较高、难以再生利用。近年来，国内外致力于样品前处理技术的改进。磁固相萃取法（Magnetic solid phase extraction，MSPE）是在固相萃取基础上发展起来的一种前处理技术，与传统固相萃取相比，MSPE不需要填柱，也避免了固相萃取柱易堵塞和高背压等问题[9-10]。MSPE吸附剂可以很好地分散到样品萃取液中，与目标物充分接触，并通过外加磁场实现快速分离的目的，具有萃取时间短、操作简单等优点。

共价有机骨架（Covalent organic frameworks，COFs）是由C、N、O、B等元素通过共价键连接的新型多孔纳米材料，具有大的比表面积、良好的化学和热稳定性、可调的多孔结构和π共轭体系等性质，已广泛应用于样品前处理中[11-13]。BaP是分子直径约为1.1 nm的芳香族化合物，而COF-DQTP的孔径为23Å且具有大的π共轭体系。COF-DQTP与BaP之间的π-π共轭作用和孔径匹配应，使得COF-DQTP有望作为吸附剂应用于BaP的富集检测中。

作者采用共沉淀法快速简便地合成了磁性共价有机骨架（Fe3O4/COF-DQTP），作为MSPE的吸附剂，结合高效液相色谱-荧光检测器（HPLC-FLD）检测，建立一种BaP的检测方法（MSPE-HPLC-FLD方法），并成功应用到烤肉（烤鱼、烤羊肉和烤牛肉）中BaP的检测。

1 材料与方法

1.1 试剂

实验所有的试剂均为分析纯及以上纯度。苯并[a]芘标准品（质量分数96%）：上海阿拉丁试剂有限公司产品；1，2，3-三醛基间苯三酚（TP）、2，6-二氨基蒽醌（DAAQ）：上海麦克林生化科技有限公司产品；N，N-二甲基乙酰胺（DMA）、乙酸水溶液（体积分数36%）、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、硫酸亚铁七水合物（FeSO4·7H2O）、氯化铁六水合物（FeCl3·6H2O）、氨水：中国国药集团化学试剂有限公司产品；甲醇、乙腈、乙醇（均为色谱级）：赛默飞世尔科技有限公司产品；Milli-Q超纯水仪（18.2 MΩ·cm）：美国默克密理公司产品。

1.2 仪器及色谱测定条件

IS10傅里叶变换红外光谱（FT-IR）仪（400~4 000 cm-1）：美国Nicolet公司产品；JEM 2100F透射电子显微镜（TEM）：日本电子JROL公司产品；e2695高效液相色谱仪（配备2475 FLR荧光检测器）用于苯并[a]芘的分离检测）、ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美国沃特世科技有限公司产品。

流动相：乙腈-水（体积比80︰20），等度洗脱，流速为1.5 mL/min。进样体积为10 μL。荧光检测器：激发波长为369.0 nm，发射波长为404.0 nm。单个样品检测时间为20.0 min，BaP在11.7 min处出峰。

1.3 Fe3O4/COF-DQTP的制备

参照文献[14-15]合成COF-DQTP。将34.0 mg（0.142 mmol）的2，6-二氨基蒽醌（DAAQ）和20 mg（0.096 mmol）的1，2，3-三醛基间苯三酚（TP）溶解在1 mL N，N-二甲基乙酰胺中，并加入50 μL乙酸（6 mol/L）作为催化剂。超声混匀后，将获得的混合物转移到衬有特氟隆的高压釜中，并在363 K下加热48 h。获得产物分别用N，N-二甲基乙酰胺、超纯水、乙醇和丙酮离心洗涤多次，直到上清液颜色变为透明，除去未反应的配体和溶剂，获得深红色产物COF-DQTP。最后，将合成的COF-DQTP在60℃下真空干燥过夜，机械研磨后备用。采用共沉淀法制备Fe3O4/COF-DQTP。制备步骤如下：将70 mg COF-DQTP、0.5 g Fe3O4·7H2O和0.8 g FeCl3·6H2O分散在200 mL超纯水中，超声处理后，将上述悬浮液加热到80℃并充分搅拌，逐滴加入氨水将pH调节至10，悬浮液会迅速从黄色变为黑色，在该温度下保持搅拌状态30 min；冷却至室温，获得的黑红色固体Fe3O4/COF-DQTP可以在外加磁场的作用下收集，然后用超纯水和乙醇洗涤，在60℃下真空干燥过夜。

1.4 样品收集及处理

未烤制过的生猪、牛、羊肉购于江南大学附近的超市，烤鱼、烤牛肉、烤羊肉样品购于江南大学附近的烤肉店。将样品经过绞肉机均质化，准确称取3.0 g样品置于50 mL离心管中，加入15 mL乙腈超声处理20 min；再将样品经过10 000 r/min离心10 min，收集上清液，将样品残渣再加入15 mL乙腈进行提取；再次重复上述超声和离心操作，合并两次上清液，过滤处理后，放入冰箱备用。

1.5 磁固相萃取实验

首先，将30 mg Fe3O4/COF-DQTP磁性吸附剂加到30 mL BaP标准溶液或样品提取液中，在室温下摇床振荡20 min后，通过磁力分离Fe3O4/COFDQTP吸附剂和上清液，弃上清液；再用5 mL乙腈解吸两次，每次用摇床匀速振荡10 min，使用磁铁分离吸附剂和洗脱液，合并两次的洗脱液，并用0.22 μm滤膜过滤去除杂质，最后通过HPLC-FLD测定BaP的含量。

2 结果与讨论

2.1 磁固相萃取-高效液相色谱法的建立

Fe3O4/COF-DQTP磁性材料对烤肉中苯并[a]芘的检测方案如图1所示。首先将烤肉样品均质，用乙腈进行超声辅助提取，离心取上清液，重复提取步骤以保证对样品的充分提取，过滤得到澄清透明的烤肉提取液。Fe3O4/COF-DQTP磁性材料对烤肉提取液中BaP进行萃取，磁力分离去上清液，彻底除去样品基质和杂质。然后加入解吸溶剂将吸附在磁性材料上的BaP洗脱下来，收集解吸液，进入HPLC-FLD进行定量分析。

图1 磁固相萃取-高效液相色谱法检测烤肉中BaP方案Fig.1 Schematic diagram for magnetic solid phase extraction method for BaP detection in roast meat

2.2 表征

通过FT-IR表征COF-DQTP和Fe3O4/COFDQTP的结构信息。从图2可知，COF-DQTP在1 569 cm-1和1 251 cm-1处有很强的特征峰，分别对应着C=C和C—N拉伸，这说明合成过程中发生了烯醇结构到酮式结构的转变，表明COF-DQTP合成成功。在Fe3O4/COF-DQTP的谱图中，除了C=C和C—N拉伸，还观察到585 cm-1处的吸收，对应于Fe—O—Fe的振动峰，说明成功合成了Fe3O4/COFDQTP。

图2 DQTP、Fe3O4和Fe3O4/COF-DQTP的FT-IR谱图Fig.2 FT-IR spectra of COF-DQTP,Fe3O4 and Fe3O4/COF-DQTP

从低倍数的透射电子显微镜（TEM）图像中可以看出，合成的Fe3O4/COF-DQTP大多呈球形，颗粒分布较为均匀，如图3（a）所示。从高倍数的TEM图像中可估算Fe3O4/COF-DQTP的平均粒径为20 nm，如图3（b）所示。吸附剂颗粒分布均匀和较小的粒径有利于萃取的进行。

图3 Fe3O4/COF-DQTP的TEM图像Fig.3 TEM images of Fe3O4/COF-DQTP

2.3 条件优化

2.3.1 吸附剂用量的优化分别探究了5、10、20、30、40 mg的Fe3O4/COF-DQTP萃取30 mL 20 μg/L的BaP标准溶液的效果。由图4可以看出，当Fe3O4/COF-DQTP质量在5~30 mg时，峰面积随着吸附剂质量的增加而增大，当吸附剂质量大于30 mg时，峰面积不再有明显的增加，表明Fe3O4/COF-DQTP质量在30mg时即可达到较好的萃取效果，因此选择30 mg作为实验的吸附剂质量，即吸附剂用量为1 mg/mL。

图4 Fe3O4/COF-DQTP吸附剂用量对萃取效果的影响Fig.4 Effect of the amount of Fe3O4/COF-DQTP adsorbent

2.3.2 解吸溶剂的优化解吸溶剂决定了目标物是否能从吸附剂上完全洗脱，所以解吸溶剂的选择是十分重要的。对比了甲醇、乙醇和乙腈3种有机溶剂的解吸效果后，结果显示乙腈解吸效果远优于甲醇和乙醇（见图5）。此外，根据BaP的溶解性，也考察了固相萃取法常用的洗脱剂，如甲苯、正己烷以及二氯甲烷的解吸效果，发现Fe3O4/COF-DQTP在这3种溶剂中不能很好地分散，这对吸附、解吸以及磁分离过程都造成阻碍。因此，最终选择乙腈作为解吸溶剂。

图5 解吸溶剂对萃取效果的影响Fig.5 Effect of the eluents

2.3.3 萃取时间的优化萃取时间对萃取效果具有双重影响，时间过短使得萃取不充分，时间过长会延长实验时间。因此，研究了萃取5、10、20、30、40 min对萃取效果的影响。如图6所示，Fe3O4/COFDQTP对BaP的萃取可以在20 min内达到最大的峰面积，所以选择20 min作为萃取时间。萃取时间在20~40 min峰面积不升反而有所下降，猜测吸附在20 min之前就已经达到平衡，而吸附时间越长，BaP与吸附剂之间的结合越紧密，也就越难解吸。

图6 萃取时间对萃取效果的影响Fig.6 Effect of the extraction times

2.3.4 解吸时间的优化解吸时间是影响解吸效果的主要条件之一，解吸时间过短会导致解吸不充分，使得解吸效果不佳。在2~20 min优化了解吸时间对解吸效果的影响，由图7可以看出，在短时间内（5 min）就可以达到很好的解吸效果，峰面积随着时间的增加而增加；但在10 min后，峰面积随着时间增加有小幅度的增加，峰面积在统计学上没有显著性的差异，所以选择10 min作为最佳的解吸时间。

图7 解吸时间对萃取效果的影响Fig.7 Effect of the desorption times

2.3.5 解吸体积的优化如图8所示，考察了解吸体积为5、10、10（2×5，等体积解析两次）、15、20 mL的解吸效果。理论上，解吸体积越小富集倍数越大，也可减少溶剂的使用，但同时解吸效果也有所减弱。在相同的解吸体积下，多次解吸效果优于一次解吸，用5 mL乙腈解吸2次的解析率就大于1次10 mL乙腈解吸。所以选择解吸效果最好的10（2×5）mL作为解吸体积和解吸方式用于之后的实验。

图8 解吸体积对萃取效果的影响Fig.8 Effect of the desorption volume

2.4 方法学研究

将制备的Fe3O4/COF-DQTP磁性材料作为磁固相萃取的吸附剂，与高效液相色谱联用，建立了一种检测烤肉中BaP的方法。在最优条件（即吸附剂用量为1 mg/mL、乙腈作为解吸溶剂、萃取时间为20 min、解吸时间为10 min、解吸体积为10（2×5）mL）下，建立的MSPE-HPLC-FLD方法在BaP质量浓度为0.5~100.0 μg/L条件下，峰面积与BaP质量浓度呈现良好的线性关系，相关系数（R2）为0.999 8，拟合线性回归方程为y=41 099x+10 670，检出限（S/N=3）为0.14 μg/L，定量限（S/N=10）为0.47 μg/L，日内和日间相对标准偏差分别为3.5%（n=5）和3.9%（n=5），如图9所示。

图9 Fe3O4/COF-DQTP萃取不同质量浓度BaP的色谱图及峰面积与BaP质量浓度的标准曲线Fig.9 Chromatograms of Fe3O4/COF-DQTP extracting BaP with different concentrations and calibration plot of peak areas versus BaP concentrations

2.5 方法比较

经过文献调研，将已报道的BaP检测方法和本文中建立的磁固相萃取法相比较。为了更加全面进行对比，列举了各方法的前处理方法、样品基质、分析方法、检出限、线性范围等参数（见表1）。结果显示，建立的MSPE-HPLC-FLD方法与文献报道方法具有相当的检出限和定量限，较宽的线性范围，这可能与磁COF材料与BaP之间具有较强的π-π共轭作用和孔径效应有关。

表1 文献方法与本文建立方法对比Table 1 Comparison of the proposed method with the previous works

2.6 实际样品

为验证方法的准确性和适用性，将所建立的MSPE-HPLC-FLD方法用于富集和检测烤肉中的BaP，样品中以10.0、20.0、30.0 ng/g 3个水平加入BaP标准物，并计算其在不同种类烤肉中的加标回收率。结果如表2所示，在3种烤肉样品（烤鱼、烤牛肉和烤羊肉）中均有BaP检出，根据基质磁固相萃取法所拟合的线性方程，换算可得到质量分数分别为19.5、17.3、16.0 ng/g，均超过国家标准GB 2762—2017所规定的肉及制品中BaP的限量5.0 μg/kg。加标回收实验结果显示，烤鱼的加标回收率为110.8%~123.4%，烤牛肉的回收率为92.6%~101.0%，烤羊肉的回收率为76.0%~111.3%，相对标准偏差≤10.6%。