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基于比色和荧光双信号检测戊唑醇的免疫层析试纸条的构建

2022-02-17蔡伊娜张存政彭池方

食品与生物技术学报 2022年1期
关键词:比色探针纸条

赵 赟, 蔡伊娜, 张存政, 彭池方*

(1.食品科学与技术国家重点实验室,江南大学,江苏 无锡 214122;2.江南大学 食品学院,江苏 无锡 214122;3.深圳海关食品检验检疫技术中心,广东 深圳 518045;4.江苏省农业科学院,江苏 南京 210014)

戊唑醇(Tebuconazole,TEB)是一种广谱、高效、低毒且药效持续时间长的新型三唑类杀菌剂[1],在农业生产中应用广泛,可以控制蔬菜、水果和谷物的病原真菌,以保证农产品的产量和质量。然而,杀菌剂的滥用存在巨大的危害,如对人体健康的潜在危害以及农产品、土壤和水中的残留对环境造成污染[2]。尽管已经有许多方法可实现TEB的高灵敏度检测,如高效液相色谱法[3]和气相色谱法[4]等,但是这些方法存在仪器昂贵、检测烦琐、耗时和要求专业人员等限制,使其难以实现TEB的现场检测。因此,开发高灵敏、低成本的戊唑醇检测方法具有重要意义。

免疫层析技术(Lateral flow immunoassay,LFIA)是一种基于色谱层析技术和纳米标记物[5]的即时检测技术。目前,基于纳米材料的改性或修饰是提高LFIA检测性能的重要途径之一[6]。例如多巴胺(Dopamine,DA)作为一种稳定的功能化修饰材料受到广泛关注。Xu等[7]使用H2O2辅助DA氧化聚合为聚多巴胺(Polydopamine,PDA),成功在金纳米颗粒(Gold nanoparticles,AuNPs)表面修饰不同厚度的PDA壳层,提高了与玉米烯酮抗体偶联的稳定性和检测灵敏度。Choi等[8]在碱性条件下使DA自聚合到AuNPs表面,并利用PDA良好的黏附性,将荧光标记的发夹DNA链固定在表面。Liu等[9]通过将PDA修饰到AuNPs表面,成功将CuInZnS量子点结合在该复合材料表面,AuNPs-PDA核壳结构不仅增强了电化学发光强度,而且大大削减了荧光淬灭的程度。量子点(Quant dot,QD)具有稳定性强,荧光发射强度高和发射波长可调等优点,常被作为标记物来提高LFIA的灵敏度和稳定性[10]。例如高晓龙等[11]将羧基化CdSe/ZnS量子点与犬细小病毒单克隆抗体5G7共价偶联,制备出量子点免疫层析试纸条,其灵敏度达到1×103TCID50/mL,显著高于传统胶体金试纸条。Sheng等[12]根据ZnCdSe/ZnS量子点的淬灭机理,将代表阳性的消线信号转换为显线信号,显著提高了四环素类抗生素检测的裸眼检出灵敏度。

本研究中通过H2O2辅助制备Au@PDA,并以Au@PDA为荧光淬灭体,以喷涂在T线上的ZnCdSe/ZnS量子点作为荧光供体,构建了一种基于反向荧光增强的双信号放大免疫层析模型,实现了对戊唑醇的快速半定量检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

氯金酸、卵清蛋白、多巴胺盐酸盐(DA·HCl)、柠檬酸三钠:上海国药控股化学试剂有限公司产品;戊唑醇:Sigma公司产品;表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子点:世纪珈源量子点技术有限公司产品;戊唑醇单克隆抗体:作者所在实验室制备;实验用水均为18.2 MΩ·cm的Millipore超纯水,其余试剂均为市售分析纯。

ZQ2000微电脑自动斩切机:上海金标生物科技有限公司产品;GT-710手持式食品安全分析仪:北京勤邦生物技术有限公司产品;紫外分光光度计:江苏贝普科学仪器有限公司产品;WH220-R磁力搅拌器:北京维根技术有限公司产品;ZX1000三维喷点平台:上海百道贸易有限公司产品;台式高速冷冻离心机:中国赛默飞世尔科技有限公司产品。

1.2 AuNPs和Au@PDA的合成

参照文献[13]中制备方法。将实验所用的三角瓶、搅拌子用重铬酸和浓硫酸混合液浸泡过夜,然后用蒸馏水反复冲洗,再用超纯水漂洗,烘干待用;准确量取99.5 mL的超纯水于三角瓶中,加入500 μL质量分数2%的氯金酸溶液,搅拌均匀后加热;待溶液沸腾后一次性加入5 mL的1 g/dL柠檬酸三钠,继续加热至溶液颜色变为酒红色,当溶液颜色稳定时,停止加热,慢速搅拌30 min后取下,自然冷却至室温后存放到4℃冰箱保存待用。

参考文献[14]中合成方法,稍做改动。取1 mL制备好的AuNPs溶液,10 000 r/min离心30 min,并使用Tris-HCl(pH 9)重悬,加入4 μL体积分数为3% H2O2充分搅拌均匀,分别加入10、20、30 μL 5 mg/mL DA·HCl(分别记为Au@PDA-50、Au@PDA-100、Au@PDA-150),室温下避光反应1 h,待溶液由酒红色变为红褐色后10 000 r/min离心30 min,并加入超纯水复溶,放置4℃冰箱待用。

1.3 Au@PDA-mab的制备

取1 mL上述制备得到的Au@PDA溶液,使用0.1 mol/L的K2CO3调节pH至7,置于磁力搅拌器上并缓缓加入7 μg戊唑醇单克隆抗体;避光反应1 h后加入10 μL质量分数20%BSA封闭30 min,封闭完成后10 000 r/min离心30 min,去除上清液后加入100 μL超纯水复溶。

1.4 量子点-卵清蛋白(QDs-OVA)的合成

参照文献[15]中偶联方法,稍做改动。具体如下:取100 μL表面羧基化ZnCdSe/ZnS量子点(8 μmol/L),以50 mmol/L的硼酸缓冲液(pH 6)稀释至600 nmol/L,加入0.1 mol/L的K2CO3调节pH至5~6,慢速搅拌条件下加入15 μL 10 mg/mL EDC溶液,室温下避光反应4 h;随后加入1.8 mg卵清蛋白,继续反应过夜至反应结束后置于4℃储存。

1.5 免疫层析试纸条的组装

免疫层析试纸条主要由样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜(NC膜)、聚氯乙烯底板(PVC底板)和吸水垫5部分组成(见图1)。将玻璃纤维膜裁成长度15 mm的长条作为样品垫,经处理液浸泡后37℃烘干。将玻璃纤维膜切成长度6 mm的长条作为金标垫,并使用处理液浸泡后37℃烘干。将Au@PDA-mab探针喷涂在金标垫于37℃烘箱烘干30 min后备用。将吸水垫裁成长度10 mm的长条,按图1所示将各部分组装完毕。使用划膜机将包被原和量子点-卵清蛋白复合物的混合物喷涂在NC膜上作检测线(T线),将羊抗小鼠二抗喷涂在NC膜上作为控制线(C线),两线间距6 mm。烘干后,使用自动斩切机裁成长度4 mm的长条,置于37℃下烘干6 h后装入含有干燥剂的封口袋中待用。

图1 双信号免疫层析试纸条的结构示意图Fig.1 Schematic illustration of immunochromatographic test strip

1.6 反应条件的优化

基于双信号读取模式,先对Au@PDA裸眼比色模式的条件进行优化,以T线颜色的色差为指标,对PDA层厚度、pH、抗体加入体积和包被原(TEBBSA)质量浓度进行条件优化;随后,在紫外光照射条件下,继续对量子点浓度和探针体积作为优化条件,以荧光恢复最小浓度为优化指标,得出最佳参数。

式中:ΔPPI为在阳性条件下和阴性条件下,试纸条上T线读取到的信号的差值;PPI0为在阴性条件下检测时,T线条带的像素分辨率;PPI1为在阳性条件下检测时,T线条带的像素分辨率

2 结果与讨论

2.1 AuNPs和Au@PDA的表征

如图2所示,通过DA聚合反应,在AuNPs表面可形成均匀的壳层。壳层的厚度随着DA加入量的增加而增加,并且,其吸光度也有显著增加(见图3),这有利于试纸条比色信号的增强。DA对AuNPs的包裹,是由于DA在碱性条件下很容易氧化自聚合形成PDA,并且具有非常强的黏附作用[16],而这源于其表面含有丰富的3,4-二羟基-L-苯丙氨酸(DOPA)和赖氨酸[17]。并且,上述Au@PDA对抗体的结合也不同于传统胶体金通过静电吸附标记抗体,而是通过PDA借助表面较强的奎宁-氨基作用,以及迈克尔加成反应[18],使得与抗体偶联更加稳定。

图2 AuNPs和Au@PDA的TEM图Fig.2 TEM images of AuNPs and Au@PDA

图3 AuNPs/Au@PDA和QD的紫外吸收光谱和荧光光谱Fig.3 UV-vis and fluorescence spectra of AuNPs/Au@PDA and QD

表面羧基化的量子点通过活泼酯法将卵清蛋白偶联到量子点表面。当Au@PDA距离QDs-OVA足够近时,QDs发出的荧光强度将会显著下降甚至淬灭,这是由于Au@PDA的紫外吸收光谱特征峰和量子点的发射光谱特征峰重叠程度大(见图3),导致量子点发出的荧光被Au@PDA吸收,即发生了荧光共振能量转移(FRET)[15]。所设计比色和荧光双信号检测试纸条的检测原理如下:当样品中不含有戊唑醇时,T线喷涂的包被原捕获Au@PDA探针,FRET作用下荧光被淬灭,如图4(a)所示;而当样品中存在目标物时,竞争作用下结合到T线上的Au@PDA数量减少,荧光逐渐恢复,如图4(b)所示。

图4 试纸条荧光检测的原理Fig.4 Principle of fluorescent detection with LFIA strip

2.2 反应条件的优化

2.2.1 PDA层厚度的影响向1.2中AuNPs溶液里分别加入50、100、150 μg的DA,反应结束后测定紫外吸收峰(见图3)分别在525、531、537 nm处,且溶液颜色逐渐加深,制备的AuNPs模板特征峰在518 nm处;随后,从TEM表征中(见图2)可测出壳层厚度分别为2.0、3.5、4.2 nm,当PDA层厚度为3.5 nm时(DA加入质量100 μg),检测线的像素值差ΔPPI最高(见图5)。应用Au@PDA提高了试纸条检测的信号响应,这可主要归结于两方面:一方面PDA修饰金纳米颗粒使其比表面积增大,增加纳米粒子表面吸附的抗体量;另一方面,所得到的Au@PDA的吸光度增加。因此选用加入质量为100 μg作为DA最佳加入量。

图5 比色检测模式条件下PDA层厚度的优化Fig.5 Optimization of thickness of PDA layer in colorimetric detection mode

2.2.2 抗体加入体积的影响当Au@PDA表面标记抗体足够时,探针才会足够稳定不至于在盐溶液中发生聚沉[19],但过量的抗体不仅会造成抗体的浪费,同时也会降低对戊唑醇的响应。如图6所示,当抗体加入体积超过10 μL时,ΔPPI逐渐下降,因此选用抗体加入体积10 μL为最优条件。

图6 比色检测模式条件下抗体加入量的优化Fig.6 Optimization of amounts of antibody in colorimetric detection mode

2.2.3 pH的影响抗体偶联标记物的环境是影响抗体标记物效果的重要因素之一,对于静电吸附而言,pH达到抗体等电点时最适合抗体的标记,但由于PDA与抗体发生的是共价键的结合,如图7所示,可以看到pH为7时ΔPPI最大,随着pH逐渐升高PPI0逐渐下降,说明迈克尔加成反应不适于在碱性条件下进行,因此,pH为7时是标记抗体的最佳环境。

图7 比色检测模式条件下pH的优化Fig.7 Optimization of pH in colorimetric detection mode

2.2.4 包被原质量浓度的影响当T线上包被原质量浓度过高时,T线上就会吸附过多的探针,从而导致阳性检测时T线信号值响应程度下降。由图8可以看出,当T线上包被原质量浓度从0.25 mg/mL逐渐增大到1.00 mg/mL时,PPI0逐渐增大,捕获到的探针数量增多,但ΔPPI在0.50 mg/mL质量浓度条件下达到最高,说明包被原质量浓度在0.5 mg/mL条件下最利于目标物的检出。

图8 比色检测模式条件下TEB-BSA质量浓度的优化Fig.8 Optimization of concentration of TEB-BSA in colorimetric detection mode

2.2.5 量子点和Au@PDA-mab探针负载量的影响在上述优化条件下,选取了3个浓度的量子点和金标垫上不同体积的探针相互作用,如图9所示,当T线上喷涂量子点浓度为300 nmol/L时,紫外光照射条件下,只能在干燥的条带上读取微弱的荧光信号,而当样品加入后,量子点荧光信号被背景值覆盖(见图9(a));当量子点浓度为900 nmol/L时,紫外光照射条件下能够清楚的识别出荧光信号,但是随着探针体积的增多,并不能观察到荧光淬灭的现象,即使探针最大加入体积达到3 μL依旧无法完全淬灭(见图9(c));而当量子点浓度调整为600 nmol/L时,不仅能够清楚地辨别出T线上的荧光条带,同时在探针体积加到3 μL时可以观察到荧光刚好被淬灭,因此3 μL探针体积和600 nmol/L量子点浓度为最适荧光淬灭体积和浓度。

图9 Au@PDA对量子点淬灭效应的优化Fig.9 Optimization of the quenching effect of Au@PDA toward quantum dots

2.3 试纸条的检测灵敏度

在上述最优反应条件下,利用Au@PDA对QDs的荧光淬灭作用,将戊唑醇质量浓度的负反馈信号转换为正反馈信号,结合Au@PDA本身裸眼比色,构建出一种双信号读取方法来检测农药残留物戊唑醇。以含有体积分数5%甲醇的PBS缓冲溶液作为溶剂,对戊唑醇标准品梯度稀释配置一系列质量浓度溶液;两种信号读取方式中,均以裸眼能够观察到消线或显线的最小质量浓度作为定性检测限(见图10),在裸眼比色条件下,当戊唑醇质量浓度达到1 μg/mL时T线消失,因此1 μg/mL为裸眼比色的检测限。在紫外光照射条件下,随着戊唑醇质量浓度的升高荧光强度也逐渐升高,裸眼观察到T线荧光出现的最小质量浓度为100 ng/mL,因此100 ng/mL为荧光检测的定性检测限。以上结果表明,裸眼检测时,荧光检测比比色检测的灵敏度提高了10倍。关于戊唑醇检测方法的报道较少,如Danks等[20]建立了一种用于定量检测戊唑醇的竞争性ELISA方法,其最低检出质量浓度为20 ng/mL。侯世澄等[21]利用戊唑醇对牛血清白蛋白的内源荧光淬灭作用,建立荧光光度法检测戊唑醇,其检出限为0.66 μg/mL。由于本方法采用的是肉眼判别结果,考虑到采用层析试纸荧光读数仪一般可以提高其检测灵敏度一个数量级左右[11-12],因此,本方法与上述的戊唑醇检测的方法对比,其灵敏度、便携性和操作简便性都具有一定的优势。许俊丽等[13]将胶体金探针和样品溶液在微孔孵育一段时间后,建立基于湿法胶体金免疫层析的戊唑醇检测方法,对戊唑醇检测灵敏度达到6.25 ng/mL。尽管本研究中的方法灵敏度低于上述方法,但是本方法基于干法检测,只需要一步操作,且无需仪器读取,因此更能体现试纸操作简单、成本低和灵敏度高等优点。

图10 试纸条检测对戊唑醇的灵敏度Fig.10 Sensitivity of detecting tebuconazole

2.4 特异性分析实验

分别选用10 μg/mL的丙环唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇三唑类杀菌剂和1 μg/mL的戊唑醇作为可能存在的农药残留共存物进行特异性实验。如图11所示,10 μg/mL的丙环唑、腈菌唑、多效唑、己唑醇并没有引起T线上信号的响应,这说明本方法对于戊唑醇的检测具有良好的特异性。

图11 试纸条检测戊唑醇的特异性Fig.11 Specificity of tebuconazole test strip

2.5 实际样品中的检测

根据许俊丽等[13]对果蔬的预处理操作,将黄瓜用食品粉碎机打碎成泥浆状,然后取10 g样品于50 mL离心管中,然后在涡旋仪上振荡15 min,并分别加入10 mL乙腈和1~3 g NaCl,振荡混匀30 min,随后在5 000 r/min条件下离心5 min使样品残渣、水相和有机相分层。准确吸取5 mL上层提取液于10 mL离心管中,氮气吹干,残留物加入5 mL缓冲液(体积分数5%甲醇-PBS混合液)复溶后加入戊唑醇标准品使其质量浓度分别为0、50、100、500 ng/mL和1 μg/mL用作试纸条检测,但首先需要去除基质干扰效应,如表1所示。将基质以两倍梯度稀释,结果发现当稀释倍数为16倍时对试纸条结果读取没有影响,基于荧光及比色检测灵敏度分别为100 ng/mL和1 μg/mL,检测结果表明添加质量浓度≥100 ng/mL和≥1 μg/mL时,浓缩提取后用体积分数5%甲醇-PBS稀释16倍时,检测结果可与缓冲液配制标准液一致。上述结果表明,乙腈提取黄瓜样品时基质存在较明显干扰,但是通过缓冲液适当稀释既可以消除样品基质对上述试纸条检测戊唑醇的干扰。上述试纸条的荧光检测模式,对黄瓜中戊唑醇的定性检测限为0.8 mg/kg。我国对黄瓜中戊唑醇的残留限量为1.0 mg/kg,因此,本研究中的试纸条可以满足监管的要求。

表1 黄瓜中戊唑醇的检测Table 1 Detection of tebuconazole(TEB)in cucumber

3 结语

本研究中基于Au@PDA抗体复合物以及半导体量子点,成功构建了一种裸眼比色和荧光双信号检测戊唑醇试纸条。通过对检测条件的优化,在荧光检测模式下,其检测灵敏度比比色检测模式提高了10倍,和其他检测方法相比本研究的方法操作过程简单、检测速度快,从而实现了对戊唑醇的高灵敏定性分析。

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