miR-196、CA125水平与老年胆囊癌患者诊断及预后的关系

崔大鹏 张迎春 刘振显 连晶晶 刘博

(河北北方学院附属第一医院 1肝胆外科，河北 张家口 075000；2普通外科；3检验科；4病理科)

胆囊癌是消化系统中起病较为隐匿的一类恶性肿瘤，早期多无典型的临床表现，很难做到早期诊断、早期治疗，导致患者5年生存率低，预后比较差〔1〕。由于胆囊癌患者临床表现特异性差，大部分仅表现为右上腹痛，甚至无明显临床表现，这对胆囊癌的早期发现、早期诊断、早期治疗提出了极大的挑战。特别是对于老年患者，及目前，影像学检查〔CT或磁共振成像(MRI)〕是最直接而有效的方法，但价格昂贵〔2〕。相较而言，肿瘤标志物敏感性和特异性俱尚可，且费用较低，具有一定推广优势〔3～5〕。但是单一肿瘤标志物在肿瘤较小时就能检测到比较困难，因此，联合检测在一定程度上可弥补单一检测的不足，提高检出率。多种肿瘤标志物联合检测可提高对早期胆囊癌诊断的敏感性和特异性。然而至今尚未发现对早期胆囊癌敏感性和特异性俱佳的肿瘤标志物或肿瘤标志物组合。目前，癌抗原(CA)125的检测已在国际上广泛用于检测。尽管具有很高的敏感性，但CA125在某些良性肿瘤患者，腹膜炎疾病患者和消化道肿瘤患者中也有显著增加〔6〕。因此，其低特异性限制了其在诊断上的准确性。microRNA(miRNA)已被证明可调节转录后基因的表达〔7,8〕，并对癌症的发展产生重大影响。同时，源自原发肿瘤组织的循环miRNA可以高度稳定的形式在血清/血浆中被检测到，突显了其在人类癌症诊断和预后中的潜在作用〔9〕。本研究探究了血清肿瘤标志物CA125和miR-196表达与胆囊癌诊断和分期的相关性，并分析了患者的预后相关性。

1 资料与方法

1.1病例资料 2017年1月至2019年1月年在河北北方学院附属第一医院住院治疗的老年(>60岁)胆囊癌患者共93例，年龄60～87岁，平均(69.2±5.1)岁，其中男46例，女47例。另外选取90例老年良性胆囊疾病患者和102例健康志愿者。良性胆囊性疾病患者中，胆囊炎患者52例，胆囊息肉患者26例，胆囊结石患者12例；男41例，女49例；年龄60～71岁，平均(66.4±4.6)岁。健康志愿者男52例，女50例；年龄45～71岁，平均(52.3±4.4)岁。胆囊癌的分期是根据胆囊癌规范化诊治专家共识(2016版)〔10〕中关于胆囊癌的分型和分期标准和AJCC胆囊癌TNM分期(第七版)/胆囊癌TNM分期分类系统进行。其中Ⅱ期12例，ⅢA期15例，ⅢB期39例，ⅣA期6例，ⅣB期21例。本次研究经过医院伦理委员会批准进行，患者签署知情同意书。胆囊癌患者纳入标准：年龄>60岁，近期被确诊为胆囊癌并经过病理证实，之前未接受过手术、化疗和其他治疗方法治疗。排除标准：患者无法完成治疗，患者之前接受过任何手术、化疗或者其他治疗方法治疗，患者患有其他严重伴性疾病，如心脏病、脑血管疾病或者精神神经类疾病。良性胆囊疾病患者和健康志愿者选择年龄和性别与胆囊癌患者相似的病例资料，并对其进行筛查以确保其在所有实验室检查结果的正常范围内，并且没有癌症史。

1.2研究方法

1.2.1血清 CA125检测 通过静脉穿刺从GBC患者、良性胆囊疾病患者和健康志愿者中采集全血样品。在采血后1 h内，以10 000 r/min离心10 min分离血清，以完全去除细胞碎片。然后将血清样品转移至无RNase/DNase的试管中，-80℃保存。 通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的CA125水平。

1.2.2miR-196检测 待测血清样品用一步PrimeScript miRNA cDNA合成试剂盒(Takara Bio,Shiga,Japan)合成血清中miRNAs的cDNA。反应混合物(20 μl)包含10 μl的29 miRNA反应缓冲液混合物，2 μl的miRNA Primescript RT酶混合物，2 μl的0.1%牛血清白蛋白(BSA)和3 μl的血清及3 μl的血清缓冲液(2.5%Tween 20,50 mmol/L Tris和1 mmol/L EDTA)，在37℃下孵育60 min，在85℃下孵育5 s，然后在4℃下孵育60 min。在4℃下以10 000 r/min离心10 min后，将cDNA在-20℃下保存直至使用。 使用ABI PRISM 7500序列检测系统(Applied Biosystems，Foster City,CA,USA)上的SYBR PrimeScript miRNA qPCR试剂盒(Takara Bio)，以25 μl的最终体积进行miRNA的qRT-PCR。反应试剂包含12.5 μl SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.5 μl染料Ⅱ，2 μl 正向引物(5 μmol/L,Ribo-bio，中国广州)，1 μl 10 μmol/L的Uni-miR qPCR引物和2.0 μl模板cDNA。用无RNA的水调节体积。进行一式三份的逆转录反应，以去除任何残留物。将miR-191-5p和U6的组合用作参考基因。而且，miRNA表达被记录为相对于两个参考基因平均值的比率。

1.2.3随访及资料收集 回顾性分析患者的临床病理数据，包括性别、年龄、组织学分化、肿瘤部位、肿瘤直径、肿瘤分期和术前肿瘤标志物(血清CA196和miR-199)。 随访时间为从治疗日期到死亡或最后一次随访，2019年8月完成随访。总生存期(OS)定义为从诊断到死亡的时间，无病生存期(DFS)定义为从诊断到首次局部或远距离复发之间的时间。如果患者的病历不完整或随访不足，则不能进行临床病理特征和预后分析。

1.3统计学分析 采用SPSS22.0软件进行Kolmogorov-Smirnov检验、U检验或t检验、χ2检验或Fisher精确检验、方差分析。使用Kaplan-Meier方法估算生存率，并使用对数秩检验比较亚组之间的生存差异，绘制受试者工作特征(ROC)曲线。

2 结 果

2.13组血清CA125水平比较 胆囊癌组CA125水平〔(51.59±24.76)U/ml〕明显高于良性胆囊疾病组〔(15.65±6.37)U/ml〕、健康志愿者组〔(11.75±4.56)U/ml，F=125.582，P<0.001〕。同时，在不同病例分期胆囊癌患者中，Ⅱ期胆囊癌患者CA125水平(28.24±3.66)U/ml明显低于ⅢA期(43.12±4.36)U/ml、ⅢB期(53.41±7.41)U/ml、ⅣA期(62.33±8.03)U/ml、ⅣB期(64.53±9.46)U/ml，ⅢA～ⅣB期(均P<0.05)。且CA125水平随着肿瘤分期增加而增高。

2.2不同组别对象及不同分期胆囊癌患者血清miR-196表达的差异 胆囊癌组血清miR-196表达(5.07±2.51)显著高于良性胆囊疾病组、健康志愿者组(1.98±1.72、1.90±1.63，F=77.627，P<0.001)。在不同肿瘤分期胆囊癌患者中，Ⅱ期患者miR-196表达水平(3.25±0.34)明显低于ⅢA期(6.03±0.83)、ⅢB期(5.01±0.61)、ⅣA期(5.83±0.68)、ⅣB期(5.32±0.46,均P<0.05)。

2.3CA125、miR-196水平与胆囊癌诊断的价值 通过比较胆囊癌与非胆囊癌患者CA125和miR-196水平，绘制相关ROC曲线，CA125的ROC曲线下面积为0.919(95%CI：0.889～0.949)，截断值为30 U/ml，敏感度为87.1%，特异性为83.9%；miR-196评分的ROC曲线下面积为0.875(95%CI：0.835～0.915)，截断值为2.537，敏感度为87.1%，特异性为76.6%。见图1。

图1 ROC分析血清CA125水平与miR-196对胆囊癌的诊断价值

2.4CA125、miR-196水平与胆囊癌预后的关系 使用血清CA125水平的最佳临界值将93例胆囊癌患者分为两组：CAP125高水平组(CA125>30 U/ml,n=71)和CAP125低水平组(CA125≤30 U/ml,n=22)。对93例胆囊癌患者的Kaplan-Meier生存分析表明，CA125>30 U/ml组无病生存率明显低于CA125≤30 U/ml组(38.4% vs 67.6%，P=0.009)，见图2。使用血清miR-196水平的曲线下面积(AUC)的最佳临界值将93例胆囊癌患者分为两组：miR-196高表达组(miR-196>2.537,n=64)和miR-196低表达组(miR-196≤2.537,n=27)。对93例胆囊癌患者的Kaplan-Meier生存分析表明，miR-196>2.537组无病生存率明显低于miR-196≤2.537组(31.4% vs 69.4%，P<0.001)，见图3。

图2 CAP125≤30 U/ml、>30 U/ml水平患者生存率

图3 miR-196≤2.537、>2.537表达患者生存率

3 讨 论

胆囊癌在消化道肿瘤中居第位，近年来，胆囊癌的发病率有逐渐增高的趋势，但早期诊断率仅为16.68%〔11〕。目前肿瘤标志物的检测无疑在早期发现和大规模筛查具有更多的优势。肿瘤标志物的检测对于肿瘤的早期诊断、疗效评价、复发及预后评估等方面均具有非常重要的意义。

已证实源自肿瘤细胞的miRNA稳定且易于在癌症患者的外周血中检测到，这可能反映了肿瘤组织中的表达模式〔12〕。血浆和血清均适合作为miRNA循环生物标志物研究〔13〕。缺氧是包括GBS在内的许多实体肿瘤的共同特征，并且与许多基因的调节有关。 miR-196是一种内源性的微小RNA，包括miR-196a-1、miR-196a-2、miR-196b 3个编码基因。早期的研究发现，miR-196主要在食管癌中高表达〔14〕，并作为癌基因参与肿瘤的发生和发展〔15〕。但是在胆管癌中，尚未见到相关诊断和预后的研究。本研究结果说明，在老年胆管癌患者和其他患者中，miR-196表达显著增高。同时，肿瘤分期也有miR-196表达有一定的相关性。miR-196可以作为一种胆管癌的早期筛查工具，对于胆管癌的早期发现具有重要的价值。miR-196的表达水平高低与患者的预后具有密切关系。目前，CA125的检测已在国际上广泛用于检测各类肿瘤，在80%的卵巢癌患者中高表达，具有一定的敏感性。但是CA125在某些良性肿瘤患者，腹膜炎疾病患者也有显著增加。也有研究发现CA125在胆囊癌中水平升高〔16〕，但是没有研究CA125水平在诊断胆囊癌中的敏感性和特异性，同时缺乏与预后的相关性。本研究结果说明CA125对于老年胆管癌具有很高的诊断敏感度和特异性。CA125作为老年胆囊癌的诊断标志物，与患者的预后具有密切关系。

综上，CA125和miR-196都可以作为老年胆囊癌早期诊断和筛查的生物标志物，并且可以作为治疗效果评价、预后分析的重要工具。