TLR7基因单核苷酸多态性与江苏淮安哮喘患者易感性的相关性研究①

邢 飞 周 瑾 姜玉新 金 跃 （徐州医科大学附属淮安医院医学检验科，淮安 223002）

支气管哮喘以慢性气道炎症、气道高反应性和可逆性气流受限为特征。主要涉及肥大细胞、T 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞。在临床上，其倾向于出现反复呼吸困难、喘息、咳嗽和胸部不适等症状。据不完全统计，全球约有3.34 亿人口罹患哮喘，每年约有18 000 人死于哮喘［1］。经典理论认为，Th1/Th2失衡是支气管哮喘发病的重要免疫机制。迄今为止，许多研究评估了基因变异和哮喘易感性间的关系。Toll 样受体家族（Toll-like receptors，TLRs）在各种免疫细胞中表达，包括抗原呈递细胞和首次遇到传入病原体的细胞（如上皮细胞），特别是树突状细胞（dendritic cells，DCs）在初始病原体感测和免疫应答的启动中发挥重要作用。DCs 是否促进Th1 或Th2 状态（以不同的细胞因子为特征）在很大程度上取决于触发TLR 的方式，而这种方式又取决于感染的类型［2-3］。TLR7 为 TLRs 家族成员，主要识别病毒单链RNA，通过MyD88信号途径诱导产生干扰素及核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）介导的免疫反应，诱导 IFN-β 等炎症细胞因子表达［4］。单个基因的异常可导致整个TLR7 信号通路缺陷，研究证实TLR7 位点多态性与多种免疫性疾病易感性相关［5］。本研究采用病例对照研究方法，探讨TLR7单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）与哮喘发病危险度的相关性。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 研究对象 哮喘患者158例设为哮喘组，患者均为2018 年3 月至2020 年10 月淮安市第二人民医院收治的门诊和住院患者，均为淮安市常住人口（≥10 年），年龄16～75 岁，平均为（44.94±19.51）岁。所有患者均符合中华医学会呼吸分会哮喘学组制定的哮喘诊断标准（2008 年修订）；健康志愿者137 例设为对照组，均为徐州医科大学附属淮安医院体检中心各项指标正常的人群，年龄13～65岁，平均为（33.57±15.31）岁，均无过敏性疾病症状或心血管病史。人口一般特征统计见表1。以上所有研究对象均签有知情同意书。

表1 哮喘组与对照组人口统计学特征Tab.1 Demographic characteristics of asthmatic and control group

1.1.2 主要试剂 人类基因组提取试剂盒及引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 样本采集及DNA 提取 采集受检者外周静脉血2 ml，用人类基因组提取试剂盒提取基因组DNA。

1.2.2 引物的设计及合成 根据网络数据库（NCBI）及Hapmap数据库公布的人类DNA 核酸序列设计特异性引物（表2），送至生工生物公司合成。

表2 3个位点的基因序列Tab.2 Gene sequences of three loci

1.2.3 PCR 扩增 反应体系 50 μl；模版3 μl，引物1 μl，dNTP 1 μl，10×Buffer 5 μl，Tap 酶 0.5 μl，双蒸水 34.5 μl，MgCl24 μl；反 应条件：95℃ 预变性5 min，94℃ 变性40 s，56℃ 退火30 s，72℃ 延伸40 s，35 个循环，最后 72℃ 延伸 5 min。取 5 μl PCR 产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳25 min，在SyngeneG：BOX荧光凝胶成像系统下分析。

1.3 统计学处理 运用SPSS24.0统计软件进行分析。正态分布的定量资料以表示，两样本均数的比较采用t检验。基因频率采用基因计数法计算，使用Hardy-Weinberg 遗传平衡定律检测样本可靠性。组间基因型及等位基因频率比较采用χ2检验，并计算OR值和95%CI。不同基因位点多态性对哮喘相对危险度采用单变量Logistic 回归分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hardy-Weinberg 平衡检测 哮喘组和对照组进行Hardy-Weinberg平衡检测结果显示样本均符合Hardy-Weinberg 遗传规律（P＞0.05，表3），说明研究样本可进行后续分析。

表3 Hardy-Weinberg平衡检测结果Tab.3 Hardy-Weinberg test results

2.2 基因型频率和等位基因频率比较 对rs179009、rs179019、rs5935436 位点在哮喘组与对照组中基因型频率和等位基因频率分布比较显示见表4、表5。在江苏淮安地区汉族人群哮喘组rs179009基因型分布与对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05），等位基因G 高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。而rs5935436 位点基因型分布与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05），等位基因C 与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。rs179019位点基因型分布与对照组相比差异具有统计学意义（P＜0.05），且等位基因C 与正常对照组相比，结果亦有统计学意义（P＜0.05）。

表4 哮喘组与对照组TLR7各位点基因频率分布［例（%）］Tab.4 Frequency distribution of TLR7 gene each loci genotypes in asthma and control group［n（%）］

表5 哮喘组与对照组TLR7 各位点等位基因频率分布［例（%）］Tab.5 Frequency distribution of TLR7 gene each loci alleles in asthma and control group［n（%）］

2.3 基因型相对危险度 如表6 所示，rs179009 基因位点相对GG 基因型而言，AA 与GA+AA 基因型均能增加哮喘发生的危险性，而GA 基因型与哮喘发病无相关性；rs179019基因位点相对CC基因型而言，AA与CA+AA基因型，亦能增加哮喘发生的危险性，而CA 基因型未发现与哮喘发病有相关性；rs5935436基因位点CT、TT型及CT+TT较CC型差异均无统计学意义（P＞0.05）。

表6 各位点不同基因型对哮喘的相对危险度Tab.6 Relative risk of asthma for different genotypes at each loci

3 讨论

哮喘是一种复杂的疾病，涉及多种物质（例如细胞因子）的细胞分泌及其他多种因素影响。其中遗传因素和环境因素间的相互作用可导致各种并发症的发生，以反复发作的喘息、咳嗽、气促、胸闷为主要特征，发病率逐年增高［6］。在临床实践中确定患者对哮喘的超敏水平至关重要。

TLR 是目前发现的一种模式识别受体，能够特异性识别细菌、病毒等多种病原微生物，进而激活机体对病原微生物的非特异性免疫应答［7］。其受体家族（TLRs），尤其是 TLR3、TLR7、TLR8 和TLR9 是启动固有免疫应答的重要分子，发挥重要的抗病毒效应功能［8］。人类TLR7 基因位于性染色体Xp22上，TLR7 介导机体抗病毒免疫，在天然和获得性免疫中发挥重要作用。支气管哮喘是以Th2应答为主的免疫失衡，激活TLR7 信号途径导致NF-κB 活化及促炎因子（如IFN-α、TNF-α和IL-12）分泌，进而使免疫应答偏向 Th0 甚至 Th1 方向［9］。既往多项研究表明，TLR7 激动剂可防止Th2 介导的气道炎症中卵清蛋白诱导小鼠发生哮喘［10-13］。TLR7 信号转导的作用不仅限于Th2定向炎症的动物模型。近期有报道称哮喘患者青少年TLR7 功能减弱，哮喘患者中由鼻病毒（TLR7的天然配体）诱导的干扰素缺乏，但在控制良好的哮喘患者中没有TLR7 功能减弱［14-15］。以上研究表明TLR7 在哮喘的发病机制中发挥关键作用。国内外TLR7 基因位点rs179007 多态性集中在肝脏免疫疾病的研究。ZHU 等［16］研究发现TLR7基因多态性在中国成年人慢性乙型肝炎感染进展中发挥重要作用，并且可能部分解释了中国男性中HBV相关疾病高发病率的原因。FAKHIR 等［17］研究发现 TLR7 基因 rs179008-T 和 rs179009-G 等位基因在男女中均增加了HCV 疾病进展的风险。而MØLLER-LARSEN 等［18］研究发现 TLR7 和 TLR8 相关的4种表型（哮喘、鼻炎、特应性皮炎和特异性IgE均升高）中，TLR7和TLR8的SNP与单倍型均存在显著关联。哮喘发病与TLR7 基因位点rs179008 多态性具有较强的相关性。TORMANEN 等［19］研究发现TLR7 基因位点rs179008 多态性可能增加婴儿毛细支气管炎后学龄前儿童患哮喘的风险。而ZHANG等［20］在研究 TLR7 和 TLR8 多态性与中国汉族人群哮喘发病相关性时发现TLR7 和TLR8 基因多态性可能在哮喘的发病机制中起重要作用，其中rs179009 基因位点与哮喘患者FEV1%及哮喘严重度相关。SHAN 等［21］研究发现，与健康志愿者相比，哮喘患者中TLR7 rs179009 基因型频率更高，与本研究结果基本一致。本研究发现TLR7 基因位点rs179009与江苏淮安地区汉族哮喘显著相关。而对于rs179019 位点研究多集中在其他免疫疾病方面。KAWASAKI 等［22］发现 TLR7 内含子 SNP rs179019 和系统性红斑狼疮相关，在亚洲人群系统性红斑狼疮中有易感性。RAAFAT等［23］研究发现rs179019多态性在系统性红斑狼疮患者和对照组间的基因型分布无统计学差异。ZHANG等［24］研究发现TLR7基因rs179019位点的A等位基因不是严重手足口病的危险因素。YUE 等［25］确定了 TLR7（rs179019/rs3853839）C 等位基因与中国女性HCV 的发生有关，CC 型和AC 型单倍型具有针对中国女性的HCV 持久性的保护作用。BARBARASH 等［26］发现 TLR7 中 rs179019位点与广东女性患Graves 病的风险增加有关。本次研究发现rs179019 位点多态性与江苏淮安哮喘患者发病相关。TLR7基因rs5935436位点与免疫性疾病相关性研究相对较少，TRAKS 等［27］发现 TLR7 SNP rs5935436、rs179013 和 rs179008 区域在整个白癜风及其亚组分析中产生了较弱的等位基因关联。ZHANG 等［20］发现 rs5935436SNP 的 T 等位基因对男性哮喘的发展有保护作用。rs5935436 的CT/TT 基因型在患有过敏性鼻炎的女性哮喘患者中偶尔出现。SHAN 等［21］发现 TLR7 基因 rs5935436 的启动子区域SNP 与慢性阻塞性肺疾病和非小细胞肺癌的风险均相关。SHAN 等［21］研究表明 TLR7 rs5935436位点SNP 与小儿哮喘间不存在显著相关性，与本研中TLR7 rs5935436 位点与淮安汉族人群哮喘发病无相关性的结论一致。

综 上 ，TLR7 基 因 位 点 rs179009、rs179019 和rs5935436 多态性与各类免疫系统疾病相关性不尽相同，提示种族差异和遗传背景的不同可能会影响TLR7 基因多态性在免疫疾病遗传机制中的作用。本研究表明TLR7 基因3 个位点多态性在哮喘易感基因中表现亦不同，这可能与哮喘发病的复杂性有关。总之，不同地区人群的基因SNP 与同一疾病的相关性不同，今后需选取更大样本，更多人群，多种族开展研究，以便为哮喘的治疗提供可靠依据。