丙戊酸钠通过下调NCX表达缓解大鼠神经病理性疼痛的实验研究

徐梅玲 申大年 张育珠 （青海省第五人民医院疼痛科，西宁 810007）

神经病理性疼痛（neuropathic pain，NP）是由外周和中枢神经系统损伤或功能障碍引起的疼痛，神经损伤是NP 发生的常见病因，会诱发疼痛传感器异常表达，特别是疼痛上传通路背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）内感觉神经元传感器的变化，且目前尚无根治方法［1］。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitor，HDACI）有稳定情绪、神经保护和抗炎作用，在缓解NP 中具有较好的前景，但具体机制尚不明确［2］；其中丙戊酸钠（sodium valproate，VPA）作为 HDACI 的一种，在创伤性颅脑损伤中可诱导坏死细胞凋亡、降低炎症因子水平从而保护神经［3］。在NP中抑制钙钠交换蛋白（sodiumcalcium exchanger，NCX）逆向作用可抑制 TNF-α 表达、抑制钙离子超载作用从而缓解镇痛［4］。推测VPA 可能影响NCX 的表达从而实现对疾病的保护。因此，本研究右侧坐骨神经结扎手术建立坐骨神经慢性压迫损伤（chronic constriction injury，CCI）致NP模型，VPA处理后初步探究其机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF 级、健康雄性SD 大鼠购自上海斯莱克动物科技有限公司，许可证号：SCXK（沪）-2016-0109，体质量（200±20）g。所有大鼠均在温度（24±1）℃、湿度（50±5）%、12 h光照/12 h黑暗条件下自由饮水摄食，每天对鼠笼清理并消毒，定期更换垫料，暂养7 d。本研究经本院伦理委员会审核并批准。

1.1.2 试剂与仪器 VPA（杭州制药有限公司，批号：A2270/2CA45）；NCX 激动剂E4031（美国 MEC 公司，编号：HY-15551）；大鼠TNF-α、IL-1β ELISA试剂盒，一抗兔抗组蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX、β-actin（英国 Abcam 公司，货号分别为：ab208348、ab197742、ab19845、ab32117、ab32369、ab187139、ab177952、ab8226）。电子 Von Frey 刺激针（美国Frey Haris 纤维机械公司，型号：Von Frey Hairs Von Frey Filaments）；热辐射仪（意大利 Ugo Basile 公司，型号：Ugo Basile38450）；实时荧光定量 PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）仪（美国 ABI 公司，型号：7500）；蛋白凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司，型号：GelDoc EZ）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药处理 实验分为假手术组、模型组、VPA 组、VPA+E4031 组，每组 10 只。所有大鼠腹腔注射40 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉，除假手术组外其余各组建立CCI 模型［5］，分离右侧坐骨神经，4.0 丝线在坐骨神经中段间隔2 mm 结扎，共结扎4次，仅留缢痕而不阻断血供，分层缝合皮肤。假手术组仅暴露出坐骨神经而不结扎。参考吴飞翔等［6］鞘内置管，左掌压住鼠身，拇指、中指固定大鼠，沿腰中线切开皮肤，暴露L5～L6 间隙，L5 棘突处垂直剪开，剔除部分L6 棘突，暴露出L5～L6 间的三角间隙，小针穿破硬膜，夹取PE-10导管延穿刺孔插入1 cm 左右，闭合管口、缝合皮肤。实验后及建模后腹腔注射100 mg/ml 的氨苄青霉素防止感染。置管成功当天建模后的第3、5、7、10 天VPA 组鞘内注射1 mg/kg VPA，VPA+E4031组在同天鞘内注射1 mg/kg VPA 和150 μg/kg E4031，VPA、E4031 均用VPS 溶媒溶解，进针4 cm 左右，针头斜向下，针头触及椎骨有抵挡感停止进针［7］。假手术组和模型组鞘内注射等体积VPS溶媒。

1.2.2 机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）的测定 分别于造模前，建模后的第 1、3、5、7、10 天，所有大鼠置于有机透明玻璃箱（容积：长20 cm×宽12 cm×高20 cm）中限制其活动，箱底放0.5 cm×0.5 cm 网格铁丝网，每次实验前大鼠适应15 min，测定MWT。电子Von Frey 刺激针刺激大鼠右足底，从1.0 g开始，逐渐增加纤毛折力，反射的最小刺激强度即为MWT，共测量3 次，计算其平均值为MWT。

1.2.3 缩足反射潜伏期（paw withdraw thermal latency，PWTL）的测定 MWT 实验结束 1 h，热辐射照射大鼠右足底，其快速抬足或添足即停止，记录持续时间即为PWTL，共测量3 次，计算平均值为PWTL。

1.2.4 ELISA 检测脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平 造模第14天立即处死大鼠，分离L4～L6 DRG组织置于-80℃冰箱待用；分离L4～L5 段脊髓组织，加入预冷的磷酸缓冲液，4℃、8 000 r/min 离心 10 min 收集上清，大鼠 TNF-α、IL-1β ELISA 试剂盒检测脊髓中TNF-α、IL-1β水平。

1.2.5 qRT-PCR 检 测 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 水平 -80℃ 冰箱取DRG，Trizol 法提总RNA，反转录为cDNA，qRT-PCR仪扩增，引物序列见表1。上样体系：cDNA 1 μl、2×Mix 10 μl、正向引物/反向引物（10 μmol/L）各0.5 μl、ddH2O 8.0 μl。扩增程序：95℃ 5 min，94℃20 s，62℃ 80 s，40 个 循 环 。 采 用 2-ΔΔCt法 计 算HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blot 法 检 测 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白表达 部分DRG加RIPA裂解液冰上研磨组织，4℃、13 400 r/min离心20 min，收集上清为总蛋白，上样20 μg 行SDSPAGE，NC 膜转膜，转膜后加入一抗 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX、β-actin 4℃ 孵育过夜，加入对应二抗，ECL 化学发光液显色，Image J 软件定量扫描蛋白条带灰度值，目的蛋白相对表达水平=目的蛋白灰度值/β-actin灰度值。

1.3 统计学分析 所有数据用SPSS24.0软件进行统计学分析，计量数据均采用表示，多组间比较行单因素方差分析，进一步两两比较行SNK-q检验。P＜0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 VPA 对大鼠 MWT 的影响 造模前，4 组 MWT差异无统计学意义（P＞0.05）。建模后第1、3 天，与假手术组相比，模型组、VPA 组、VPA+E4031 组MWT 降低（P＜0.05）。建模后第（5、7、10）天，与假手术组相比，模型组MWT 降低（P＜0.05）；与模型组相比，VPA 组MWT 升高（P＜0.05）；与VPA 组相比，VPA+E4031组MWT降低（P＜0.05）。见表2。

表2 4组大鼠不同时间点MWT比较（，n=10）Tab.2 Comparison of MWT at different time points in 4 groups（，n=10）

表2 4组大鼠不同时间点MWT比较（，n=10）Tab.2 Comparison of MWT at different time points in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

10 d after modeling 26.23±3.15 7.15±1.061）20.66±2.082）14.46±2.153）134.700＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P Before modeling 26.48±3.17 27.05±4.08 26.98±2.18 26.86±3.41 0.060 0.980 1 d after modeling 23.45±2.18 13.46±1.581）14.46±1.521）13.98±2.581）55.873＜0.01 3 d after modeling 24.33±2.65 10.68±1.921）13.18±2.251）11.45±1.971）82.497＜0.01 5 d after modeling 24.95±3.08 8.19±2.061）15.68±1.952）9.48±1.863）111.527＜0.01 7 d after modeling 25.45±3.08 7.69±1.281）18.45±2.062）12.64±1.583）131.086＜0.01

2.2 VPA 对大鼠 PWTL 的影响 造模前，4 组PWTL 差异无统计学意义（P＞0.05）。建模后第1、3 天，与假手术组相比，模型组、VPA 组、VPA+E4031组PWTL 降低（P＜0.05）。建模后第5、7、10 天，与假手术组相比，模型组PWTL降低（P＜0.05）；与模型组相比，VPA 组PWTL 升高（P＜0.05）；与VPA 组相比，VPA+E4031组PWTL降低（P＜0.05）。见表3。

表3 4组大鼠不同时间点PWTL比较（，n=10）Tab.3 Comparison of PWTL of rats in 4 groups at different time points（，n=10）

表3 4组大鼠不同时间点PWTL比较（，n=10）Tab.3 Comparison of PWTL of rats in 4 groups at different time points（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

10 d after modeling 14.67±2.17 6.01±1.621）12.98±2.532）9.89±2.413）29.659＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P Before modeling 15.65±1.15 15.53±2.14 15.38±1.29 15.59±2.09 0.045 0.987 1 d after modeling 12.62±2.48 7.45±1.681）7.95±1.911）7.81±2.061）14.246＜0.01 3 d after modeling 12.98±1.65 7.14±1.831）9.14±2.041）7.48±1.951）20.418＜0.01 5 d after modeling 13.45±1.86 6.87±1.691）11.15±1.952）8.15±1.863）25.933＜0.01 7 d after modeling 14.05±1.83 6.34±1.581）12.48±2.122）9.15±2.153）31.770＜0.01

2.3 VPA 对大鼠脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平的影响 与假手术组相比，模型组脊髓中TNF-α、IL-1β水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，VPA 组脊髓中TNF-α、IL-1β 水平降低（P＜0.05）；与VPA 组相比，VPA+E4031 组脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平升高（P＜0.05）。见表4。

表4 4组大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β水平比较（，n=10）Tab.4 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in spinal cord of rats in 4 groups（，n=10）

表4 4组大鼠脊髓中TNF-α、IL-1β水平比较（，n=10）Tab.4 Comparison of TNF-α and IL-1β levels in spinal cord of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

IL-1β 24.56±3.46 86.11±6.561）46.16±7.152）68.15±6.493）192.407＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P TNF-α 186.16±21.16 406.59±15.481）248.18±31.152）374.86±24.483）192.281＜0.01

2.4 VPA 对大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA 水 平 的 影 响 4 组 DRG 中HDAC8 差异无统计学意义（P＞0.05）。与假手术组相比，模型组 DRG 中 HDAC1、HDAC2、NCX mRNA水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，VPA 组DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX mRNA 水平降低（P＜0.05）；与 VPA 组 相 比 ，VPA+E4031 组 DRG 中HDAC1、HDAC2、NCX mRNA 水平升高（P＜0.05）。见表5。

表5 4组大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA水平比较（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

表5 4组大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX mRNA水平比较（，n=10）Tab.5 Comparison of mRNA levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

NCX 0.98±0.11 2.18±0.151）1.56±0.182）1.95±0.243）88.462＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P HDAC1 1.01±0.12 1.85±0.231）0.86±0.152）1.34±0.243）52.184＜0.01 HDAC2 0.99±0.09 2.34±0.261）1.24±0.182）1.86±0.123）121.543＜0.01 HDAC3 1.01±0.14 1.21±0.21 0.95±0.152）1.09±0.19 4.132 0.013 HDAC8 1.02±0.15 1.25±0.32 1.28±0.21 1.38±0.35 3.178 0.065

2.5 VPA 对大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白水平的影响 与假手术组相比，模型组 DRG 中 HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX 蛋白水平升高（P＜0.05）；与模型组相比，VPA 组DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、NCX 蛋白水平降低（P＜0.05）；与 VPA 组 相 比 ，VPA+E4031 组 DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX 蛋白水平升高（P＜0.05）。见图1、表6。

图1 4组大鼠DRG 中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平Fig.1 Protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups

表6 4组大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平比较（，n=10）Tab.6 Comparison of protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

表6 4组大鼠DRG中HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、NCX蛋白水平比较（，n=10）Tab.6 Comparison of protein levels of HDAC1，HDAC2，HDAC3，HDAC8 and NCX in DRG of rats in 4 groups（，n=10）

Note：Compared with sham operation group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with VPA group，3）P＜0.05.

NCX 0.11±0.02 0.46±0.051）0.13±0.022）0.34±0.043）233.469＜0.01 Groups Sham operation Model VPA VPA+E4031 F P HDAC1 0.37±0.05 0.89±0.051）0.08±0.012）0.78±0.043）836.219＜0.01 HDAC2 0.42±0.04 1.05±0.061）0.38±0.042）0.71±0.083）291.919＜0.01 HDAC3 0.56±0.06 0.89±0.091）0.35±0.042）0.54±0.063）119.053＜0.01 HDAC8 0.95±0.10 1.05±0.12 1.02±0.11 1.17±0.133）6.311＜0.01

3 讨论

NP 一直是治疗的难点和热点，神经损伤导致DRG 神经元异常兴奋，不断向脊髓背角神经元发出冲动，脊髓组织中小胶质细胞异常激活，小胶质细胞异常激活可产生大量细胞因子、炎症介质等，进而增强脊髓北角神经元兴奋，过量的物质积累聚集在脊髓背角可持续诱发病理性疼痛［8-9］。阻断神经元的过度兴奋等过程可能缓解疾病。本研究发现，与假手术组相比，模型组MWT、PWTL 降低，提示建立模型后NP 大鼠出现明显的机械痛敏和热痛敏症状，可能与神经元异常兴奋有关。

NCX 通过1 个钙离子与3 个钠离子交换模式实现对胞内外钙浓度平衡的调节，正常情况下将钙离子从细胞内泵出，病理状态下将钙离子泵入细胞，诱发细胞内钙离子超载，而钙离子大量内流可激活第二信使钙-钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ，活化后与NMDAR 亚单元 2B 结合，增加 NMDAR 活性，增强突触作用，增强痛觉［10-11］。在NP中NCX 活性增加是增加伤害性阈值的原因之一［12］。本研究发现，与假手术组相比，模型组DRG中NCX水平升高，提示NP中确实存在钙离子内流，增强痛觉，加重NP。疼痛是神经系统对伤害刺激的感觉，而补体与某些病理性疼痛关系密切，补体旁路激活会导致炎症反应和出现组织损伤［13］。TNF-α、IL-1β 作为炎症因子，在NP中水平升高，且与抑郁样行为关系密切［14］。本研究发现，与假手术组相比，模型组脊髓中TNF-α、IL-1β水平升高，提示NP脊髓中炎症明显，损伤神经元。

VPA 作为HDACs抑制剂，是临床上常用广谱抗癫痫药，可通过血脑屏障进入中枢神经系统，抑制神经相关基因合成从而抑制癫痫；可降低钠离子浓度，抑制神经元去极化，维持神经细胞膜稳定性，抑制异常放电；且可降低炎症因子水平，减少炎症对神经元的损伤［15］。本研究发现，使用 VPA 后，NP 大鼠的机械痛敏和热痛敏症状得以缓解，可能是VPA能降低钠离子浓度，抑制神经元去极化，维持神经细胞膜稳定性；同时减少炎症反应，实现对神经元的保护，但具体抑制的HDAC 尚在探索。HDACs 作为一种翻译后修饰酶，可去除核小体核心组蛋白氨基末端赖氨酸残基中的乙酰基，促使染色体凝聚，从而阻止转录激活子进入其靶位点，抑制转录；分4 类 ，其 中 Ⅰ 类 包 括 HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8 4 个基因，与神经发育关系密切［16］。NP 中HDAC1抑制剂LG325可显著减轻损伤引起的疼痛，并且LG325可阻止c-Jun磷酸化途径从而减轻伤害，但尚未发现 HDAC3 的变化［17］；升高 HDAC2 可影响下游基因水平变化可促进钠离子和钙离子内流，导致神经元内钙离子水平升高，进而诱导突触结构和功能的可塑性改变；同时直接影响疼痛相关因子如谷氨酸脱氢酶6 的表达，且HDAC2 与炎症基因关系密切，HDAC2 水平升高可募集炎症基因复合物，从而降低组蛋白乙酰化、染色质重塑［18-19］。但又有研究发现是HDAC2 而非HDAC1 通过调节Kv1.2 表达而参与NP 过程［20］。本研究发现，与假手术组相比，模型组 DRG 中 HDAC1、HDAC2 mRNA 和蛋白水平升高；与模型组相比，VPA 组 DRG 中 HDAC1、HDAC2 mRNA 和蛋白水平降低，变化趋势较一致，脊髓中 TNF-α、IL-1β 水平，DRG 中NCX mRNA 和蛋白水平降低，提示可能是通过抑制HDAC1、HDAC2从而抑制下游通路，减少炎症水平从而加强组蛋白乙酰化、染色体重塑；减少钙离子内流，增强突触结构稳定和增强突触可塑性实现的。且增加NCX 水平可逆转上述情况，提示VPA 抑制NCX 实现对NP大鼠的保护。

综上所述，VPA 下调 NCX 实现对 NP 大鼠的保护，且起到缓解炎症的作用。但VPA 抑制HDAC1或者HDAC2 或二者皆有作用影响NCX 尚不明确，是接下来研究重点。