蒜氨酸微丸-蒜酶肠溶双层片制备工艺优选及体外抗肿瘤作用评价*

方奕巍，朱文涛，陈金明△

（1.赣南医学院第一附属医院，江西 赣州341000；2.江西青峰药业有限公司，江西 赣州 341000）

大蒜的主要有效成分为大蒜辣素［1−2］，由蒜氨酸在蒜酶催化裂解作用下产生，具有抗肿瘤活性等多种物理学活性［3−5］，但性质不稳定，在空气中易分解，故将蒜氨酸和蒜酶制备成新制剂［2］，使其进入人体后生成大蒜辣素，从而发挥治疗作用。微丸表面圆整，粒径均匀，流动性良好，有利于包衣工艺，并可将包衣微丸压制成片，提高药物与胃肠道的接触面积，使药物吸收完全，从而提高生物利用度，且使用方便［6］。本研究中制备了蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片，并以人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株Bel−7402、人白血病细胞株HL−60、人正常肝细胞L02为研究对象，初步评价了蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片的体外抗肿瘤作用。现报道如下。

1 仪器、试药与细胞

1.1 仪器

DP30A型单冲压片机（北京新龙立科技有限公司）；AT−7型溶出仪（瑞士Sotax公司）；JBZ−200型挤出滚圆造粒机（辽宁医联新药研究所）；小型流化床包衣机（沈阳药科大学制药厂）；Waters e2695型高效液相色谱仪（美国Waters公司）；YD−20KZ型硬度仪、FT−2000AE型脆碎度检查仪（天津市天大天发科技有限公司）；BGZ−140型电热鼓风干燥箱（上海博迅实业有限公司）；ME104E型电子天平（瑞士梅特勒−托利多公司，精度为万分之一）；Varioskan Flash型连续光谱多功能酶标仪（美国Thermo Fisher公司）。

1.2 试药

蒜氨酸（由本实验室提取，纯度大于95%）；蒜氨酸对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号为YY91278，含量为98%）；蒜酶（新疆埃乐欣药业有限公司，批号为201902012）；微晶纤维素（MCC，Dupont Nutrition USA，批号为P119832791）；低取代羟丙基纤维素（L−HPC，Shin−Etsu Chemical Co.，Ltd.，批号为5091344）；交联聚维酮（PVPP，德国BASF公司，批号为75892806170）；羧甲基淀粉钠（CMS−Na，安徽山河药用辅料有限公司，批号为181108）；丙烯酸树脂（Eudragit®L30D−55，德国Degussa公司，批号为B150814348）；羟苯乙酯（中国食品药品检定研究院，批号为100847−201604，含量为99.9%）；甲醇（色谱纯，天津市康科德科技有限公司）；甲酸（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；其余试剂均为分析纯。

1.3 细胞

人宫颈癌细胞株HeLa、人肝癌细胞株Bel−7402、人白血病细胞株HL−60、人正常肝细胞L02均由江西中医药大学提供，均接种于15%灭活胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的1640培养液中，置5%饱和相对湿度、37℃的CO2孵箱中贴壁生长。

2 方法与结果

2.1 蒜氨酸分析方法［7-8］

2.1.1 外标溶液制备

取蒜氨酸对照品4.8 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，用纯水溶解并定容，即得质量浓度为48 µg/mL的蒜氨酸对照品溶液。

2.1.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH=5）−甲醇（95∶5，V/V）；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃；检测波长：214 nm；进样量：20µL。

2.1.3 方法学考察

线性关系考察：取蒜氨酸对照品30.6 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用流动相定容，即得质量浓度为612 µg/mL的对照品贮备液；依次量取对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mL，并用流动相定容至50 mL容量瓶中，即得质量浓度分别为1.22，2.45，6.12，12.24，24.48，61.20，122.40，244.80 µg/mL的系列对照品溶液。按2.1.2项下色谱条件进样测定，以蒜氨酸的色谱峰面积（A）为纵坐标、质量浓度（C，µg/mL）为横坐标进行线性回归，得回归方程A=1.112×104C+123.5（r=0.999 8，n=8）。结果表明，蒜氨酸的质量浓度在1.22～244.80 µg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取质量浓度为61.20 µg/mL的对照品溶液适量，按2.1.2项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果蒜氨酸峰面积的RSD为0.73%（n=6），表明仪器精密度良好。

加样回收试验：取蒜氨酸10 mg，精密称定，平行3份，置20 mL容量瓶中，用流动相定容；准确移取该溶液各1 mL，置10 mL容量瓶中，分别加入线性关系考察项下质量浓度为612 µg/mL的对照品贮备液各0.1，1.0，3.0 mL，用流动相稀释并定容，按2.1.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积，按外标法计算加样回收率。结果蒜氨酸的平均加样回收率为98.60%，RSD为0.86%（n=9）。

2.1.4 蒜氨酸浓度计算

蒜氨酸浓度按公式CX=AX×CS/AS计算，其中，CX为供试品溶液浓度，AX为供试品溶液峰面积，CS为对照品溶液浓度，AS为对照品溶液峰面积。

2.2 大蒜辣素分析方法［9］

2.2.1 内标溶液制备

取羟苯乙酯15.1 mg，精密称定，置50 mL容量瓶中，用60%甲醇溶解并定容，即得质量浓度为302 µg/mL的内标贮备液；移取5 mL内标贮备液，置50 mL容量瓶中，定容，即得质量浓度为30.2 µg/mL的羟苯乙酯内标溶液。

2.2.2 色谱条件

色谱柱：Kromasil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：甲醇−1%甲酸（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：25℃；检测波长：242 nm；进样量：25µL。

2.2.3 大蒜辣素浓度计算

大蒜辣素浓度按公式CX=4.71×D×AX×CS/AS计算，其中，4.71为校正因子，CX为供试品溶液浓度，D为样品稀释倍数，AX为供试品溶液峰面积，CS为对照品溶液浓度，AS为内标峰面积。

2.3 蒜氨酸速释微丸制备

2.3.1 制备工艺

以MCC为填充剂，以2%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液为润湿剂，加入适量崩解剂，采用挤出滚圆法制备蒜氨酸速释微丸，工艺参数设置为挤出频率30 Hz，滚圆频率40 Hz，滚圆时间30 s，60℃烘箱干燥12 h，以筛分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集，称定质量，计算收率。

2.3.2 溶出试验

以蒜氨酸溶出度为考察指标，采用2020年版《中国药典（四部）》0931溶出度与释放度测定法，设置转速为100 r/min，温度为（37±0.5）℃。取适量微丸，置装有溶出介质的溶出杯中，以人工肠液（pH 6.8磷酸盐缓冲液）为释放介质，分别测定溶出10，20，30，45，60，90 min时在人工肠液中的累积释放率。

2.3.3 工艺优选

崩解剂选择：以MCC为稀释剂，与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m），不加入崩解剂或加入5%CMS−Na，L−HPC，PVPP，混匀，按2.3.1项下方法制备蒜氨酸速释微丸，按2.3.2项下方法测定其在人工肠液中的累积释放率。结果以CMS−Na为崩解剂时，药物释放最快，故选择CMS−Na为速释微丸的崩解剂。详见图1 A。

崩解剂用量选择：以MCC为稀释剂，与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m），以2%SDS溶液为润湿剂，以CMS−Na为崩解剂，含量分别为3%，5%，7%，按2.3.1项下方法制备速释微丸，按2.3.2项下方法测定其在人工肠液中的累积释放率。结果崩解剂用量为3%时累积释放率最小，用量为5%时的累积释放率与用量为7%时的曲线类似，故崩解剂用量选择5%。详见图1 B。

A.崩解剂B.崩解剂用量C.MCC与蒜氨酸质量比图1蒜氨酸速释微丸工艺优选（n=6）A.Disintegrating agents B.Disintegrating agent dosage C.Mass ratio of MCC to alliinFig.1 Process optimization of alliin rapid release pellets（n=6）

MCC与蒜氨酸质量比选择：以MCC与蒜氨酸质量比为筛选对象，分别为0.5∶1（m/m）、1∶1（m/m）、2∶1（m/m），以5% CMS−Na为崩解剂，以2% SDS溶液为润湿剂，混匀，按2.3.1项下方法制备速释微丸，按2.3.2项下方法测定其在人工肠液中的累积释放率。结果MCC与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m）和2∶1（m/m）时的累积释放率曲线类似，且均高于质量比为0.5∶1（m/m）时的累积释放率，从增加微丸中主药蒜氨酸的占比考虑，最终选择MCC与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m）。详见图1 C。

2.3.4 验证试验

按拟订优化条件，以MCC与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m），以5% CMS−Na为崩解剂，以2% SDS溶液为润湿剂，采用挤出滚圆法连续制备3批蒜氨酸速释微丸，筛分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集，称定质量，得其平均收率为（96.41±2.10）%（n=3），在人工肠液中1.5 h的累积释放率为（93.72±4.14）%（n=3），制备的微丸表面光洁、圆整，呈淡黄色。

2.4 蒜氨酸速释微丸肠溶包衣

以丙烯酸树脂（型号为Eudragit®L30D−55）为肠溶衣膜材料，以柠檬酸三乙酯为增塑剂，以滑石粉为抗粘剂，选择粒径为0.45～0.60 mm的蒜氨酸速释微丸，分3批分别配制包衣液，使包衣增重分别为5%，10%，15%（m/m），采用流化床包衣技术包制肠溶衣，制备蒜氨酸微丸，工艺参数设置为鼓风频率30 Hz，热风温度30～35℃，包衣液流速1.2 mL/min，物化压力1.0 MPa。按2020年版《中国药典（四部）》0931溶出度与释放度测定法，取适量蒜氨酸微丸，置转篮中，设置转速为100 r/min，介质温度为（37.0±0.5）℃，以人工胃液（pH 2.0）为释放介质，2 h后加入定量0.2 mol/L磷酸钠溶液，模拟人工肠液（pH 6.8），测定蒜氨酸微丸在人工胃液中2 h和人工肠液中1 h内的累积释放率。详见图2。可见，1）包衣增重10%和15%蒜氨酸微丸在人工胃液中2 h的累积释放率均小于5%，二者累积释放率曲线类似；包衣增重5%蒜氨酸微丸的累积释放率为（11.32±2.44）%（n=6）。为减少主药蒜氨酸在胃液中因释放而造成的损失，包衣增重10%和15%的条件优于包衣增重5%。2）包衣增重5%和10%蒜氨酸微丸在人工肠溶液中1 h的累积释放率曲线类似，累积释放率分别为（92.31±4.85）%和（89.72±4.52）%（n=6），包衣增重15%的累积释放率为（78.3±4.5）%（n=6）。为提高主药蒜氨酸在人工肠液中的释放率，包衣增重5%和10%的条件优于包衣增重15%，故包衣增重选择10%。

图2 包衣增重对蒜氨酸微丸中药物累积释放率的影响（n=6）Fig.2 Effect of coating weight gain on cumulative drug release rate in alliin pellets（n=6）

2.5 蒜氨酸微丸-蒜酶肠溶双层片制备

2.5.1 制备工艺

本研究中以MCC为填充剂，以CMS−Na为崩解剂，取处方量蒜酶层粉末，填入冲模中，以8 mm平头冲预压；再填入处方量蒜氨酸微丸层，以8 mm平头冲二次压成双层片，片面平整，无粘冲现象。当蒜氨酸−蒜酶的质量比（m/m）为1∶（0.5～1.5）时，大蒜辣素产率达到最高值［10］，故表1中蒜氨酸∶蒜酶的处方比例符合要求。

表1 蒜氨酸微丸-蒜酶双层片处方（mg/片）Tab.1 Formulation of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alliinse Bilayer Tablets（mg/tablet）

2.5.2 溶出试验

以大蒜辣素产率为考察指标，按2020年版《中国药典（四部）》0931溶出度与释放度测定法，设置转速为100 r/min，温度为（37±0.5）℃，取蒜氨酸微丸−蒜酶双层片，置装有人工肠液（pH 6.8）的溶出杯中，分别吸取溶出5，10，15，30，45，60 min时的溶出液1 mL，加入1 mL质量浓度为30.20µg/mL的羟苯乙酯内标溶液，混匀，按2.2项下方法测定大蒜辣素的含量，得到人工肠液中1 h内的累积大蒜辣素产率。

2.5.3 工艺优选

蒜酶层中MCC用量选择：蒜酶吸湿性较强，流动性较差，可通过加入一定量的MCC加以改善。根据前期预试验结果，当MCC用量大于每片22 mg时蒜酶的流动性方可符合压片要求，将MCC用量上限控制在每片172 mg，使片剂总质量控制在每片200～300 mg。按表1处方压片，MCC用量分别为每片22，72，122，172 mg，使片剂总质量分别为每片150，200，250，300 mg。以大蒜辣素产率为评价指标，按2.5.2项下方法测定。详见图3。可见，溶出0～30 min内，随着MCC用量的增加，大蒜辣素产率呈递增趋势；溶出超过30 min时，MCC用量为每片72，122，172 mg大蒜辣素产率的曲线几乎重合；溶出60 min时，MCC用量为每片22 mg压制的双层片的大蒜辣素产率最低，为（79.60±4.51）%。为增加片剂中主药蒜酶占比，减少辅料添加量，故选择MCC的用量为每片72 mg。

图3 蒜酶层中MCC用量对大蒜辣素产率的影响Fig.3 Effect of MCC dosage in alliinase layer on the yield of alliin

肠溶包衣温度选择：选用Eudragit®L30D−55为肠溶衣膜材料，以柠檬酸三乙酯为增塑剂，以滑石粉为抗粘剂，使包衣增重为10%（m/m），采用流化床包衣技术对蒜氨酸微丸−蒜酶双层片进行包衣，参数设置为鼓风频率30 Hz，包衣液流速0.6 mL/min，物化压力1.0 MPa，分别在热风温度为25，30，35℃下包衣，按2.5.2项下方法测定蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片中大蒜辣素在人工肠液1 h的产率。结果分别为（86.92±2.44）%、（78.34±3.73）%、（66.52±2.90）%（n=3）。可见，大蒜辣素的产率随包衣温度的升高而降低，这与蒜酶的活性随温度升高而降低，导致大蒜辣素生成减少有关。3种温度下所得包衣片均为白色，且富有光泽，表面光滑，故选择包衣温度为25℃。

2.5.4 验证试验

按以上优选工艺，MCC与蒜氨酸质量比为1∶1（m/m），以5% CMS−Na为崩解剂，以2% SDS溶液为润湿剂，采用挤出滚圆法连续制备3批蒜氨酸速释微丸，筛分法得到0.45～0.60 mm的丸芯，收集；按2.4项下方法包衣增重10%，得3批蒜氨酸微丸；以上3批蒜氨酸微丸按2.5项下方法压片、包衣制得3批蒜氨酸微丸−蒜酶双层肠溶片，每批100片。所得片剂均为白色，且富有光泽，表面光滑；制得片剂的硬度为39.2～44.8 N，脆碎度不超过0.4%；片剂的含量均匀度分别为4.94，5.18，3.61，均小于15.0，符合2020年版《中国药典（四部）》通则0941规定。

2.6 蒜氨酸微丸-蒜酶肠溶双层片溶出试验

按优选工艺，制备3批蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片，以大蒜辣素产率为考察指标，同2.5.2项下方法测定，首先采用人工胃液（pH 2.0）为释放介质，2 h后加入定量0.2 mol/L磷酸钠溶液，模拟人工肠液（pH 6.8），测定大蒜辣素在人工胃液中2 h和人工肠液中1 h内的产率。详见图4。可见，制备的3批蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片中大蒜辣素产率曲线几乎重合，说明制备工艺的重复性较好；3批片剂在2 h内人工胃液中的大蒜辣素产率均低于5%，1 h内人工肠液中大蒜辣素产率分别 为（88.51±4.80）%、（85.20±4.53）%、（86.34±2.62）%（n=6），均高于85%，符合2020年版《中国药典（四部）》规定。

图4 蒜氨酸微丸-蒜酶肠溶双层片在人工胃液和人工肠液中的大蒜辣素产率（n=6）Fig.4 The yield of alliin of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alli⁃inse Bilayer Tablets in artificial gastric juice and artificial intesti⁃nal juice（n=6）

2.7 体外抗肿瘤作用

取蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片6片，置100 mL人工肠液中，按2.5.2项下方法测定累积释放率，30 min后开始取样，测得药液中大蒜辣素的质量浓度为1 318.91 µg/mL，此药液经1640培养液稀释，得质量浓度分别为131.89，109.91，87.93，65.95，43.96，21.98µg/mL的系列试验药液［10−11］，经0.22µm微孔滤膜滤过，除菌，测定所得药液对肿瘤细胞的抑制作用。

取对数生长期Bel−7402，HL−60，HeLa，L02细胞，以1×105的细胞浓度在96孔培养板中培养，待细胞贴满孔壁时加入系列试验药液，分别为Bel−7402组、HL−60组、HeLa组、L02组。采用噻唑蓝（MTT）比色法测定肿瘤细胞的抑制率，经药液作用后的细胞与0.5 mg/mL MTT于37℃共同孵育4 h，吸弃上清液，加入二甲基亚砜，完全溶解后使用酶标仪于492 nm波长处测定吸光度（A），细胞生长抑制率（%）=（1−A实验组/A空白对照组）×100%。数据以±s表示，行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。结果见表2。可见，蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片在人工肠液中生成大蒜辣素溶液，该药液对人正常肝细胞L02的影响很小，抑制率最高不超过10%；以L02组为对照，对HL−60，Hela，Bel−7402肿瘤细胞的抑制作用均显著增强（P<0.01），且抑制强度由大到小排序为Bel−7402>Hela>HL−60（P<0.05）；对L02，HL−60，Hela，Bel−7402肿瘤细胞的抑制率随着药液浓度的增加而增大，且抑制效应呈浓度依赖性。

表2 不同质量浓度大蒜辣素蒜氨酸微丸-蒜酶肠溶双层片对肿瘤细胞的生长抑制率比较（%，n=6）Tab.2 Comparison of growth-inhibitory rate of Enteric-Coated Alliin Pellets-Alliinse Bilayer Tablets on tumor cells（%，n=6）

3 讨论

蒜氨酸储存过程中与蒜酶相遇后不稳定，易发生催化反应，生成大蒜辣素［1−2］，而大蒜辣素极不稳定。通过制备成肠溶微丸，可避免蒜氨酸与蒜酶发生反应。蒜酶性质不稳定，易吸潮，遇酸及有机溶剂易变性失活［11−12］。蒜氨酸微丸−蒜酶双层片压制成功后，通过包肠溶衣隔绝胃液，防止蒜氨酸和蒜酶进入肠道前丧失活性，避免蒜酶被胃酸破坏，提高制剂的稳定性和活性成分大蒜辣素的产率。包衣过程中要注意保证较低的温度，以最大限度地保留蒜酶的活性，故最终选择双层片的包肠溶衣温度为25℃。

双层片包衣后制备成肠溶双层片，连续考察了大蒜辣素在人工胃液中2 h和人工肠液中1 h的产率，通过包肠溶衣的方式，使蒜氨酸进入肠道后可大量释放，进而在蒜酶催化下生成大量大蒜辣素。在人工胃液中，主药蒜氨酸损失较小，大蒜辣素产率不超过5%。

本研究中评价了制备的蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片的体外抗肿瘤作用，模拟了肠溶片进入肠道后的崩解释放情况。结果显示，双层片崩解释放生成的溶出液（主要为大蒜辣素）对L02，HL−60，Hela，Bel−7402肿瘤细胞均有抑制作用，表明其被肠道所吸收而产生药效。

综上所述，优选的蒜氨酸微丸−蒜酶肠溶双层片制备工艺稳定、合理，体外溶出曲线良好，体外抗肿瘤作用明显，药物的稳定性提高，为该药物的中试研究和工业化生产奠定了基础。