耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌对抗菌药物的耐药研究

李翔，张利芳

（江苏省苏州市第九人民医院，江苏 苏州 215200）

肺炎克雷伯菌（KP）是常见于人体呼吸道、消化道的革兰阴性杆菌，也是医院或社区获得性感染的常见病原体［1−2］。碳青霉烯类抗菌药物为治疗KP的有效药物，但临床的不合理应用使耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）的检出率逐年递增［3］。本研究中探讨了CRKP的耐药方式，以提高碳青霉烯类抗菌药物的临床合理用药水平。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 仪器与试药

仪器：VITEK2−Compact型全自动微生物分析仪（法国生物梅里埃公司），配有药物敏感性（简称药敏）试验卡片；抗菌药物纸片（英国Oxoid公司）；ABI7500型基因扩增仪（美国ABI公司）；HYDRASYS型蛋白电泳分析仪，C−880V型CO2孵箱，均购自美国Sebia公司；HC−2062型高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；HulaMixer™Sample Mixe型涡旋混匀器（美国赛默飞世尔科技有限公司）。

试药：外排泵抑制剂PAβN（美国Sigma公司，批号为0001429016）；琼脂糖（批号为D31018），引物（批号为B01019），均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；Mueller−Hinton琼脂（MHA）药敏试验培养基（青岛日水生物技术有限公司，批号为071123）；标志物DL 2000（批号为A1901B），Ex Taq DNA聚合酶链式反应（PCR）试剂盒（批号为191148），均购自北京基尼亚生物技术有限公司；细菌蛋白抽提液（美国赛默飞世尔科技有限公司，批号为2191785）；肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706（批号为491227），大肠埃希菌ATCC 25922（批号为561229），铜绿假单胞菌ATCC 27853（批号为550106），均购自上海北诺生物科技有限公司；注射用美罗培南（日本住友商事株式会社，批号为201701023）；注射用亚胺培南（默沙东<中国>有限公司，批号为S012103）。

1.2 菌株来源

选取我院2017年1月至2020年12月收治的非重复性CRKP感染患者的耐药菌株97株，分别编号为1−97号，均经VITEK2−Compact型全自动微生物分析仪分析确定对碳青霉烯类抗菌药物耐药。

1.3 药敏试验与细菌测定

采用VITEK2−Compact型全自动微生物分析仪对细菌进行鉴定和分类，并对抗菌药物的敏感性进行初始检测，操作步骤按仪器说明书进行。部分抗菌药物无药敏试验卡片，参考美国临床和实验室标准协会（CLSI）发布的《抗菌药物敏感试验执行标准第27版信息增刊》（简称《标准》）中Kirby−Bauer（K−B）法进行补充试验，质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA1706、大肠埃希菌ATCC 25922与铜绿假单胞菌ATCC 27853［4］。

1.4 外排泵抑制试验

参考《标准》中琼脂稀释法测定分离菌的最低抑菌浓度（MIC），分别测定添加及未添加外排泵抑制剂PAβN（终质量浓度为20 mg/L）的美罗培南和亚胺培南的MIC，两者的测定质量浓度均为0.06～128.00 mg/L，每个质量浓度均接种10 000 cfu细菌。与未添加外排泵抑制剂PAβN相比，添加后的MIC提高4倍以上，即为细菌有外排泵机制［5］。

1.5 碳青霉烯酶筛选试验

改良Hodge试验：参考《标准》，将0.5麦氏浊度的致泻性大肠埃希菌ATCC 25922用无菌生理盐水稀释10倍，均匀涂抹于琼脂平板上，于中间位置贴放10 µg厄他培南纸片，接种环从纸片边缘至平板外缘划线接种待检菌株，置35℃环境过夜培养。若次日厄他培南抑菌圈长出矢状生长物，则视为待检菌产碳青霉烯酶。

Carba NP试验：取0.5%酚红溶液2 mL，纯水16.6 mL，10 mmol/L硫酸锌溶液180 mL，置25～50 mL烧杯中，用10%盐酸溶液或0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至7.7～7.9，作为A液；在A液中加入质量浓度为6 mg/mL的亚胺培南溶液（无菌注射用水配制），作为B液。取2支微量离心管，分别标记为a管和b管，均加入100µL细菌蛋白抽提液与1µL过夜培养的琼脂平板接种环待测物，涡旋振荡5 s，在a管中加入100µL A液，在b管中加入100 µL B液，涡旋，混匀，置35℃CO2孵箱中孵育2 h，每30 min查看并记录颜色变化［6−7］。

1.6 PCR扩增和序列分析

采用煮沸法提取与纯化细菌基因组DNA，以此为模板，采用PCR法扩增碳青霉烯酶［肺炎克雷伯菌产碳青霉烯酶（KPC）、AmpCβ−内酰胺酶（AmpC）类、新德里金属β−内酰胺酶1（NDM−1）、超广谱β−内酰胺酶（ESBLs）类］基因，即分别为blaKPC、blaAmpC类和blaNDM−1、blaESBls类。以1.2%琼脂糖凝胶电泳检测产物，经凝胶成像系统分析，由生工生物工程（上海）股份有限公司专业人员测定扩增产物的序列，并同GenBank数据库中的序列进行比对，以确认扩增的产物为靶基因片段及基因型［8］。

1.7 肠道细菌基因组重复序列（ERIC）-PCR同源性分析

引 物 序 列：ERIC1为5′−ATGTAAGCTCCT⁃GGGGATTCAC−3′，ERIC2为5′−AAGTAAGTGACT⁃GGGGTGAGCG−3′。扩增条件：95℃下预变性7 min，94℃下变性1 min，45℃下退火1 min，65℃下延伸4 min，30个循环；65℃下延伸16 min，1个循环；将扩增的产物放入1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，电泳条件为电压100 V，时间100 min，Tris硼酸电泳缓冲液（20倍稀释）［9］。

2 结果

2.1 药敏试验

共分离出97株CRKP，且对碳青霉烯类抗菌药物的耐药率均为100.00%；对氨基苷类、头孢类、喹诺酮类抗菌药物的耐药率均超过85.00%；对四环素类抗菌药物的耐药率均低于25.00%。详见图1。

图1 97株CRKP对临床常用抗菌药物的耐药率Fig.1 Drug resistance rate of 97 CRKP strains to commonly used antibiotics in the clinic

2.2 碳青霉烯酶筛选试验

93株CRKP的改良Hodge试验和CarbaNP试验结果均为阳性，阳性检出率为95.88%；4株（编号分别为24，31，68，72号）CRKP的CarbaNP试验结果为阳性，而改良的Hodge试验结果为阴性；3株（编号分别为6，13，93号）CRKP的改良Hodge试验及CarbaNP试验结果均为阴性。

2.3 耐药基因检测结果

97株CRKP中，blaKPC的检出率为89.69%（89/97），且均为blaKPC−2型酶；blaNDM−1的检出率为71.13%（69/97）。blaESBLs类耐药基因中，blaSHV，bla⁃TEM，blaCTX−M的检出率分别为96.00%，77.00%，61.00%；blaAmpC类耐 药基因中，blaDHA，blaFOX，blaCTT的检出率分别为100.00%，87.00%，61.00%；未检出blaAAC，blaEBC，blaGES，blaMOX，blaOXA−48，blaSME，blaVEB，blaVIM。blaKPC，blaNDM−1，blaTEM在CRKP耐药基因中更具代表性［10］，其PCR扩增产物电泳图见图2。

M.Maker 1，4，7.阳性菌珠2，5，8.阴性对照3，6，9.阳性对照图2 CRKP部分耐药基因PCR扩增产物电泳结果M.Maker 1，4，7.Positive strains 2，5，8.Negative control 3，6，9 Positive controlFig.2 Electrophoretogram of PCR amplification products of partial drug resistance genes of CRKP

2.4 外排泵抑制试验

9株CRKP（编号分别为3，18，25，30，39，58，75，86，94号）有细菌外排泵机制，提示主动外排泵参与了部分KP对碳青霉烯类抗菌药物的耐药机制，9株菌株耐药基因的检出率均大于85%。

2.5 ERIC-PCR基因分型

共发现9种类型的CRKP，参考文献［11−12］，判断各菌株的基因分型，其中1型42株，4型15株，5型14株，6型、8型各6株，2型、7型各4株，3型、9型各3株。部分耐药菌株的ERIC−PCR基因分型见图3。

3 讨论

碳青霉烯类抗菌药物在体内外均对革兰阴性杆菌有抑制作用，是临床治疗KP的首选药物，但随着应用的增多，KP属细菌对其耐药的比例越来越高，部分治疗多重耐药KP感染有效的药物（如亚胺培南、美罗培南等）已陆续出现耐药现象，且呈不断上升趋势［7］。

本研究中从非重复性CRKP感染患者体内分离出97株CRKP，其在对碳青霉烯类抗菌药物耐药的同时，对氨基苷类等其他抗菌药物亦有不同程度的耐药。虽对四环素类抗菌药物耐药率较低，但该类抗菌药物毒副作用较大，长期应用可对患者的消化、泌尿、血液、中枢神经等系统造成严重损害，并非为针对CRKP感染患者的首选药物［13］。可见，CRKP作为一种高耐药、高毒力的多重耐药菌，其有效抗菌药物的选择范围较窄。

CRKP最主要的耐药机制为产生碳青霉烯酶［14］，水解青霉素类、头孢类、碳青霉烯类等抗菌药物。碳青霉烯酶在国内以KPC常见，也有耐亚胺培南（IPM）等。本研究中发现，CRKP感染患者存在多重耐药基因积聚共存及外排泵抑制现象，与文献［15−16］中提出的高产碳青霉烯酶（以KPC−2型酶为主），产AmpC酶伴外膜孔蛋白缺失或表达下调，主动外排泵系统异常活跃等导致革兰阴性菌对碳青霉烯类抗菌药物耐药的论点类似。

M.Maker 1，7.1型2，3，6，9，10，12.2型4，5.3型8.4型11.5型图3 CRKP部分耐药菌株ERIC-PCR基因分型电泳结果M.Maker 1，7.Type 1 2，3，6，9，10，12.Type 2 4，5.Type 3 8.Type 4 11.Type 5Fig.3 Electrophoretogram of genotypes of ERIC-PCR of partial drug resistance strains of CRKP

本研究中采用改良的Hodge试验与CarbaNP试验检测碳青霉烯酶表型，结果KPC−2型酶为CRKP产碳青霉烯酶的最主要亚型，这可能是导致CRKP对碳青霉烯类抗菌药物耐药的主要机制。KPC−2型酶具有单独致碳青霉烯类抗菌药物耐药形成，而不依赖于外膜孔蛋白缺失的作用，加之其基因位于质粒转座子上，经可转移的70 kb质粒编码，传播高效［17］。ERIC−PCR同源性分析发现9种CRKP，其中1型为主要流行菌株，提示1型克隆株可能更易在本院流行传播，医务人员在严格规范使用抗菌药物的基础上，还应加大医院感染防控力度。