大肠埃希菌主动外排泵的研究进展

闫向龙，石艳春，郑源强，孙瑶，孙颖，栾艳淼

(内蒙古医科大学内蒙古自治区分子生物学重点实验室，呼和浩特 010058)

大肠埃希菌属肠杆菌科埃希菌属，为革兰阴性短杆菌，在自然界中广泛存在。大肠埃希菌作为人体正常菌群存在于肠道中，可合成维生素K和B族维生素，参与宿主的物质代谢。大肠埃希菌的某些血清型可作为病原体引起肠道内感染，出现腹泻等症状。临床上分离出的大肠埃希菌可引起肠道外感染，如败血症、菌血症、肺炎、肾盂肾炎、胆囊炎和继发性腹膜炎。抗生素在治疗感染性疾病中发挥重要作用，但随着抗菌药物种类的增加以及临床不合理抗菌药物的应用，耐药菌不断产生。除细菌种属特性决定的固有耐药外，细菌产生耐药的机制还包括产生药物灭活酶、改变药物的作用靶点以及形成生物被膜等[1]。通过改变外膜通透性、主动外排等方式可减少药物的积聚和摄取。对于革兰阴性杆菌，外膜上存在的主动外排泵是导致其耐药的主要原因[2]，如大肠埃希菌的AcrAB-TolC(由膜融合蛋白AcrA、外排转运蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三部分组成)外排系统[3]、铜绿假单胞菌的MexAB-OprM(由膜融合蛋白MexA、内膜转运体MexB和外膜通道蛋白OprM组成)外排系统等[4]。这些外排系统的底物主要以各类抗生素为主，也包括一些氧化剂和有机溶剂等。现就大肠埃希菌主动外排泵的研究进展予以综述。

1 大肠埃希菌主要外排泵家族

对大肠埃希菌主动外排泵的研究发现，主要有5个跨膜转运蛋白家族参与了抗菌药物的主动外排[5]，其中，ATP结合盒(ATP binding cassette，ABC)超家族是通过ATP结合和水解推动药物自由排出的“主要活性”转运体[6]，而其他4个家族均是以质子泵获取能量的转运体，包括易化因子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐药节结化细胞分化(resistance nodulation division，RND)超家族、多药和有毒化合物排出(multidrug and toxic compound extrusion，MATE) 家族以及小多重耐药性(small multidrug resistance，SMR)家族[7-8]。研究表明，这些外排泵家族的底物具有多样性，包括抗菌剂[9]、染料、清洁剂和溶剂等[10]。

1.1MFS MFS是最大的转运蛋白家族，该家族中包含多种转运蛋白，如金黄色葡萄球菌中的QacA和大肠埃希菌中的MdfA等。MFS转运蛋白家族依靠质子的溶度梯度作为能量来源实现其功能，其转运蛋白的方式包括单向转运、逆向转运和共同转运。MFS转运蛋白的底物也有多种类型，如抗生素、细菌的代谢产物、糖类和离子等。对MFS转运机制的研究发现，MFS转运蛋白以一种“交替进入”的机制(即药物结合位点交替暴露于细胞外部或内部)运行[11]。通常情况下，MFS转运蛋白家族由一种转运蛋白构成(如金黄色葡萄球菌中的QacA)，但大肠埃希菌的多重耐药外排泵则由多种蛋白外排泵和转运蛋白共同发挥作用[12]。

1.2ABC超家族 ABC超家族利用水解ATP供能实现主动外排功能。人类ABC转运蛋白P-糖蛋白(P-糖蛋白/ABCB1)[13]、多药耐药相关蛋白1(多耐药相关蛋白1/ABCC1)[14]和乳腺癌耐药蛋白(乳腺癌耐药蛋白/ABCG2)[15]在肿瘤多重耐药中起重要作用。在细菌中，ABC外排泵并不常见，大肠埃希菌中的MacB外排泵首先在革兰阴性菌中被发现，其主要介导大环内脂类药物的外排[16]。ABC主动外排泵作用的底物种类较多，除抗生素外还包括氨基酸、糖类、离子和多糖类化合物等，功能性ABC外排泵包括2个负责药物识别和转运的跨膜结构域和2个ATP水解的细胞质核苷酸结合域，其主动外排机制是通过上述两种结构域构象的改变降低药物与底物结合的亲和力，实现其外排功能[17]。

1.3RND超家族 RND泵存在于革兰阴性菌的内膜中，具有跨膜结构域和周质结构域。RND家族主要成员包括存在于大肠埃希菌中的外排转运蛋白AcrB和铜绿假单胞菌中的内膜转运体MexB，AcrB、AcrA和TolC构成AcrAB-TolC三聚体复合物，MexB、MexA和OprM构成MexAB-OprM三聚体复合物[18]。AcrB可介导多种不同底物的转运，如阴离子、阳离子、两性离子以及抗生素、化疗药物、毒素、洗涤剂和胆盐[19]。多药耐药转运体RND家族的结构特点是膜融合蛋白AcrA、外排转运蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC跨越革兰阴性菌的双膜，并直接将有毒物质外排到细胞外环境[20]。但RND多药泵仍有待进一步深入研究，如转运体如何与质子泵配合实现其功能以及大肠埃希菌AcrA、AcrB及TolC三者之间动态转换的实现等均需通过比较晶体结构以及各结构的参数来分析[21]。

1.4MATE家族 MATE家族最早在细菌中被发现[22]，如大肠埃希菌中的洋地黄外排泵和副溶血性弧菌中的诺氟沙星外排泵。洋地黄外排泵的作用底物以抗生素为主，如链霉素、卡那霉素和环丙沙星；NorM外排泵的主要作用底物是有毒性的阳离子，如吖啶红和溴化乙啶。人类MATE转运蛋白可转运二甲双胍和西咪替丁等药物。有研究在哺乳动物中也发现了MATE家族外排泵，其主要通过尿液将药物或毒素排出体外，是一种机体解毒方式[23]。研究发现，NorM外排泵的作用底物为非药物，主要存在于霍乱弧菌和淋病奈瑟球菌中[24]。对MATE晶体结构的研究显著增强了人们对MATE家族机制的理解，MATE的晶体结构显示其有一个面向外部的空腔，大约延伸至膜的一半[25]。NorM结构(包含结合的四苯基磷或溴化乙啶)有2个细胞外环，几乎“覆盖”了药物结合位点，表明NorM外排泵的主要作用是结合非药物(如有毒化合物)的外排[26]。

1.5SMR家族 SMR家族转运蛋白长度仅100～120个氨基酸，由4个跨膜区螺旋组成，且螺旋内环相对较短，SMR家族转运蛋白存在于许多不同的细菌中[27]。迄今为止，研究最多的是大肠埃希菌中的反转运体EmrE和金黄色葡萄球菌中的SMR模孔蛋白[28]。EmrE可以输送许多不同的亲脂阳离子(如乙炔、甲醇)；EmrE的每个单体中均含有一个单膜嵌入谷氨酸残基(E14)，且EmrE是保守的SMR转运蛋白同系物，这是质子和底物结合的必要条件[29]。关于EmrE结构和生物化学研究(包括低温电子显微镜、X光晶体学、核磁共振光谱学)表明，EmrE以反向二聚体形式存在[30]。有学者通过点突变对大肠埃希菌反转运体EmrE的转运机制进行修改，结果显示，用质子替代药物恢复转运体的起始构象后，谷氨酸残基与质子进行了交换[31]。EmrE存在3种构象状态，表明结构的可塑性与灵活性是多药识别和转运的基础[32]。深入研究EmrE结构的可塑性可进一步阐明SMR转运蛋白的多种功能。

2 AcrAB-TolC外排泵的结构

大肠埃希菌是目前发现外排泵种类最多的细菌，其中以AcrAB-TolC外排泵研究较多。AcrAB-TolC外排泵属于转运蛋白RND超家族，RND超家族转运的底物广泛。RND超家族包括膜融合蛋白AcrA、外排转运蛋白AcrB和外膜通道蛋白TolC三个结构，若AcrAB-TolC外排泵系统的结构发生改变，细菌可转变为敏感状态，敲除相关耐药基因后，可增加细菌对药物的敏感性。

2.1膜融合蛋白AcrA(接合器) 与多数膜融合蛋白结构类似，AcrA由4个线性排列的结构域组成，包括膜近端结构域区、β-桶形结构域、脂酰结构域和α-螺旋发夹结构域[33]。α-螺旋发夹结构域参与了AcrA与TolC周质端的相互作用，而β-桶形结构域和膜近端结构域则与AcrB的对接结构域接触[34]。一些膜融合蛋白缺乏膜脂蛋白结构域，而其他蛋白质的α-螺旋发夹结构域长度不同或完全缺失[35-36]。膜融合蛋白组成主动外排泵方式的差异导致其功能不同，灵活的蛋白结构是蛋白识别多种底物的基础。

2.2外排转运蛋白AcrB(泵) AcrB是RND超家族的代表。AcrB可广泛识别转运底物，如抗生素(四环素、氯霉素、β-内酰胺类、新生霉素、梭状酸、萘啶酸和氟喹诺酮类)、洗涤剂(如十二烷基硫酸钠、Triton X-100)和类似清洁剂的胆盐以及阳离子染料、消毒剂，甚至非极性溶剂[37]。AcrB是一种同源三聚体，AcrB组件可分为跨膜结构域、波特域和对接域，其中波特域最靠近内膜，可分为PN1、PN2、PC1和PC2 4种亚结构域，这4种亚结构域可形成近端和远端结合囊，而近端和远端结合囊均富含与转运底物接触的芳香族、极性和带电氨基酸残基[38]。近端和远端结合囊被一个“开关环”隔开，这个“开关环”可以阻断底物运输通道，而近端和远端结合囊袋可以识别不同类型的底物，近端囊袋有利于AcrB与红霉素、利福平、β-内酰胺等抗生素的相互作用，而远端囊袋可与米诺环素或阿奇霉素结合[39-40]。AcrB可转运底物的种类繁多，但AcrB蛋白识别多种不同化学结构底物的具体过程还需结合其晶体结构以及复杂的空间计算进一步研究[41]。

2.3外膜通道蛋白TolC(通道) 外膜通道蛋白TolC可分解为3个不同的结构域，即β-桶体、α-螺旋桶体和混合α/β-折叠体(又被称为赤道结构域)[42]。TolC可被招募到许多不同的外排泵中，其中包括MFS外排泵(EmrA、EmrB和TolC)、RND型吖啶外排泵(AcrA、 AcrB和TolC)以及ABC型大环内酯泵(MacA和MacB)[43]。此外，TolC也被称为Ⅰ型分泌系统，由ABC转运体激活，并驱动致病细菌的毒性决定因子穿过细胞膜，包括黏附素、毒素或其他对人类和动物细胞定植及感染具有重要作用的蛋白质[44]。但目前ABC转运蛋白转运底物并携带底物通过TolC通道的机制尚未明确。

2.4调控机制

2.4.1局部调控 局部调控以负性调控因子AcrR为主，AcrR位于AcrAB操纵子的上游，由阻遏基因AcrR编码，能够抑制自身基因AcrR和AcrAB的表达[45]。AcrR的N端是典型的螺旋-转角-螺旋结构，AcrA通过这一结构与DNA链结合，附着于AcrAB操纵子的位点，导致该操纵子阻遏[46]。另一方面，AcrAB操纵子受转录激活因子MarA的正向调节，MarA的表达发生在MarR阻遏物从MarRAB操纵子的操作位点解离后[47]。AcrR和MarR阻遏物均具有DNA结合和药物结合位点[48]。研究表明，编码基因MarR和AcrR的突变可以保持AcrAB-TolC泵的过度激活状态，而大肠埃希菌AcrR第45位氨基酸突变可导致AcrAB过表达，这种影响的程度主要取决于细菌对四环素和环丙沙星的耐药水平[49]。

2.4.2全局调控 细菌适应外界环境变化的能力依赖于多个调节网络，这些网络以协调的方式控制基因表达，以响应环境刺激。外界刺激信号传递给转录调节因子，转录调节因子与特定开放阅读框启动子区的靶DNA相互作用，激活或抑制靶基因的表达[50]。在某种情况下，转录调节因子控制不同代谢途径的基因和操纵子，这些转录调节因子又被称为全局调控因子，以转录因子Rob、SoxS和MarA为主，主要构成MarA-SoxS-Rob调控系统，MarA-SoxS-Rob调控系统是细菌适应性反应所必需，在革兰阴性肠杆菌中高度保守，但在其他革兰阴性和少数革兰阳性细菌中未发现其直接同源物以及编码相似蛋白质的基因[51]。MarA、SoxS和Rob均是RND超家族的成员，对许多刺激存在反应，包括pH值的改变、抗生素的存在和氧化应激等[52]。mobox是全局调控系统的结合位点，可与AcrAB-TolC的启动子上游结合，从而激活相关基因的表达，MarA、SoxS和Rob的DNA结合结构域在一级序列同源性、DNA序列识别和转录激活特性方面均非常相似[53]。然而，MarA、SoxS和Rob的表达或活性由特定信号刺激产生，表明三者相互作用可以产生足够的反应，虽然每个系统均可独立发挥作用，但MarA、SoxS和Rob紧密相连，共同构成MarA-SoxS-Rob调控系统[54]。

3 外排泵抑制剂

外排泵是细菌防御的重要机制，可防止抗生素进入细胞内环境，导致抗生素耐药性产生。因此，目前的研究多集中于发现新型外排泵抑制剂或对已知抗生素进行结构修饰。外排泵抑制剂主要通过阻断外排泵与抗生素的结合降低其耐药性[55]。

研究指出，一些抗肿瘤药物(如利血平、长春新碱)可以降低肿瘤细胞的耐药性，通过抗癌药物与P-糖蛋白(属于ABC家族)结合，抑制外排蛋白的功能[56]。利血平通过抑制NorA外排蛋白阻止其对诺氟沙星的外排作用，从而提高金黄色葡萄球菌对诺氟沙星的敏感性；此外，利血平也能对抗淋病奈瑟菌对四环素、红霉素和阿米卡星的耐药性[57]。氰氯苯腙是目前研究最多的质子泵抑制剂，可抑制依赖质子浓度梯度的外排系统，破坏其外排作用，但对于依赖ATP供能的外排泵无抑制作用[58]。

4 小 结

不同外排泵家族是导致细菌耐药的主要原因，主要包括ABC超家族、RND超家族、MATE家族、SMR家族和MFS等。目前对于AcrAB-TolC外排泵的结构构象、转运机制以及调控方式等的研究均较清楚，但对于外排泵抑制剂的研究较少，且目前多处于体外实验阶段。随着细菌体内多种类型外排泵的出现以及不同耐药机制的共同作用，多重耐药菌的数量随之增加。体外试验表明，外排泵抑制剂与抗生素联合使用可在一定程度上逆转携带外排泵基因细菌的耐药性[59]，但外排泵本身的安全性等尚未在体内试验中得到验证。因此，对不同外排泵结构及转运机制进行研究的同时，还应重视外排泵抑制剂在体内的研究。