血管内皮钙黏蛋白与ABO新生儿溶血病患儿血管内皮损伤的相关性研究

刘鹏 丁建娥 姜丹丹 丁金钰 邵淑玲 董秀梅

血管内皮钙黏蛋白（VE-Cadherin，VE-Cad）是血管内皮细胞接触黏附连接的主要成分，介导Ca2+依赖的同源性内皮细胞黏附，是血管发育和通透性调节不可缺少的物质[1]。可溶性的VE-Cad可作为内皮粘附素连接破坏的标志，导致毛细血管渗漏、组织水肿和器官功能障碍[2]。已有研究报道证实，ABO血型不合新生儿溶血病（ABO-HDN）患儿的血管内皮受到损伤，且血管内皮损伤与疾病严重程度呈正相关[3-5]。因此，本实验目的在于探究VE-Cad能否预测ABO新生儿溶血病患儿血管内皮损伤及功能障碍程度。

资料与方法

1 一般资料 选取2020年4月～2020年11月我院收集的50例ABO新生儿溶血病患儿（ABO-HDN组）和47例母婴血型匹配的健康新生儿（对照组）作为对照。ABO-HDN组男21例，女29例，男女比例为1∶1.4；对照组男26例，女21例，男女比例为1.2∶1。本研究经我院医学伦理委员会组织审核批准，所有新生儿家属均知晓参与本研究，并自愿签署知情同意书。

排除标准：排除其他血型系统新生儿溶血及其他原因导致的新生儿溶血（地中海贫血症、遗传性球形红细胞症、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症等），临床诊断为感染或CRP＞10 mg/L者，围产期窒息，大的头部血肿或严重的挫伤，母亲吸烟或慢性高血压、糖尿病、系统性红斑狼疮或其他自身免疫性疾病障碍等。

2 试剂与仪器 抗-A、抗-B、ABO反定红细胞、抗-D试剂（以上试剂均由上海血液生物医药有限公司提供，且在有效期内使用），人血管内皮钙黏蛋白ELISA试剂盒（JL19938，江莱生物技术有限公司），低离子抗人球蛋白卡（微柱凝胶法）（批号：50531.44.10，瑞士达亚美公司）；DIANA免疫微柱孵育器（230-072-1361，西班牙基立福公司），振荡恒温金属浴（MB-102，杭州博日科技有限公司），医用离心机（T-24，迈克医疗电子有限公司），医用离心机（BY-150C，北京白洋医疗器械有限公司），全自动血型分析仪（IH1000，美国伯乐公司），多功能自动酶标仪（MB450，迈克医疗电子有限公司），全自动生化分析仪（DA7600，日立）。

3 研究方法

3.1 血型血清学检测及不规则抗体筛查：将患儿标本3 000 r/min离心5 min后，使用微柱凝胶卡在IH1000全自动血型分析仪上完成，稀释、加样、孵育、离心、结果判读均由仪器自动完成，操作方法严格按照标准操作规程执行。

3.2 溶血三项试验：对患儿标本进行溶血三项试验：直接抗人球蛋白试验：向抗人球蛋白检测卡中加入50 μL洗涤后的2%～5%红细胞悬液，并标明“DAT”。游离试验和放散试验：①在第1、4孔分别加入A型红细胞悬液各50 μL；在第2、5孔分别加入B型红细胞悬液各50 μL；在第3、6孔分别加入O型红细胞悬液各50 μL；②1～3孔分别加入50 μL新生儿血浆，4～6孔分别加入50 μL新生儿红细胞放散液。③将检测卡置于37℃孵育器孵育15 min。④使用专用离心机离心10 min，取出检测卡，判读结果。

3.3 VE-Cad检测：采用EDTA抗凝标本离心所得血浆进行酶联免疫吸附试验，用酶标仪在450 nm波长处测定OD值。所有操作均按照试剂操作说明进行。

3.4 观察指标：收集两组新生儿同期溶血指标：血红蛋白（Hb）、网织红细胞比率（Ret%）、间接胆红素（IBIL）、乳酸脱氢酶（LDH）的检测数据。

4 结果判定 阳性结果：红细胞抗原与相应抗体在微柱凝胶中形成的特异性抗原抗体复合物浮在凝胶表面或悬于胶中；阴性结果：红细胞完全沉降到微柱管尖底部。反应强度：特异性红细胞抗原抗体复合物完全位于胶表面，为强阳性反应；愈靠近胶底部颗粒愈小，反应愈弱。（直抗试验以出现凝集为阳性，游离和放散试验均以检出可以和新生儿红细胞反应的抗体为阳性）。

5 分组标准 根据溶血三项试验结果：直抗、游离、放散试验全部阴性的，归为对照组；放散试验阳性者，无论直抗、游离试验结果如何，均归为ABOHDN组。

6 统计学处理 采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用KS（D）检验法进行正态性检验，呈正态分布的指标用均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用One Way ANOVA方法分析；呈非正态分布的指标用中位数和四分位间距表示（IQR），组间比较采用Mann-WhitneyU检验，多组间比较采用Kruskal-WallisH检验。计数资料用百分率（%）表示，组间比较采用卡方检验或Fisher确切概率法。两因素间的相关性分析采用Spearman相关性分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 基本资料 两组新生儿的性别、出生体重、胎龄及检测日龄差异无统计学意义（P＞0.05），其中检测日龄为动态检测，分布在0.5～4天之间，见表1。

表1 实验组和对照组的基本资料比较

2 ABO-HDN组和对照组相关检测指标比较 两组新生儿Hb、Ret%、IBIL、LDH及VE-Cad水平比较差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 ABO-HDN组和对照组相关检测指标的比较

3 VE-Cad水平与溶血指标的相关性分析 ABO新生儿溶血组VE-Cad水平与IBIL、LDH、Ret%水平呈正相关，与Hb水平呈负相关（P均＜0.05），见图1。

图1 ABO新生儿溶血组VE-Cad水平与IBIL、LDH、Hb、Ret%水平相关性分析

为探索VE-Cad水平是否与IBIL、LDH、Ret%、Hb独立相关，进行了多重线性回归分析，分析发现：调整Ret%、IBIL、LDH水平之后，ABO-HDN组的Hb水平与VE-Cad水平独立相关；调整Hb、IBIL、LDH水平之后，ABO-HDN组Ret%水平与VE-Cad水平独立相关；调整Hb、Ret%、LDH水平之后，ABOHDN组IBIL水平与VE-Cad水平独立相关；调整Hb、Ret%、IBIL、水平之后，ABO-HDN组LDH水平与VE-Cad水平独立相关（P均＜0.05）。见表3。

表3 ABO-HDN组VE-Cad水平与临床变量间相关性的多重回归分析

讨 论

VE-Cad是构成血管内皮细胞间黏附连接的主要结构分子，通过与连接素和肌动蛋白细胞骨架蛋白相互作用来调节血管内皮屏障的稳定性，是血管发育和通透性调节不可缺少的物质[5]。VE-Cad可以通过三种主要形式发挥作用：完全内吞作用、胞外区脱落或在细胞膜内重新分布。由于在临床情况下不可能评价完整的钙黏附素内吞作用或细胞膜内再分布，因此患者外循环中脱落的可溶性VE-Cad可能作为内皮黏附素连接破坏的标志，导致毛细血管渗漏、组织水肿和器官功能障碍[6]。文献研究表明炎症介质和生长因子，如脂多糖、肿瘤坏死因子和血管内皮生长因子等，可以同时诱导多种形式的VE-Cad改变。在败血症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病和冠状动脉粥样硬化病中，血浆VE-Cad 水平都有所升高[7-8]。

ABO-HDN一般特指胎母ABO血型不合引起的胎儿或新生儿同种免疫性溶血性疾病，临床表现有早期流产、新生儿黄疸、贫血、肝脾肿大、水肿等，严重者可出现胆红素脑病，甚至死亡[9]。A和B血型抗原是组织血型抗原，广泛存在于人体组织和器官中，并且强烈表达于内皮细胞表面。抗-A、抗-B抗体不仅会与红细胞表面相应抗原结合引起溶血，同时也会与内皮细胞表面的靶抗原结合引起血管内皮的损伤[10]。已有研究通过测定血管内皮微粒体（Endothelial Microparticles，EMPs）证实，ABO-HDN患儿的血管内皮受到损伤，且EMPs水平与疾病严重程度呈正相关[3-4]。

因此，本研究试图通过测定内皮功能障碍的指标VE-Cad，来研究ABO-HDN患儿血管内皮完整性是否受到损害以及内皮损伤与溶血严重程度的关系。

与对照组相比，ABO-HDN组的血红蛋白水平下降，网织红细胞比率、间接胆红素、乳酸脱氢酶及VE-Cad水平升高（P＜0.05）。并且，ABO-HDN组的VE-Cad水平与血红蛋白水平呈负相关，与IBIL、LDH水平呈正相关。这些结果表明ABO-HDN存在血管内皮损伤且与疾病严重程度有关，提示重度ABOHDN患儿VE-Cad水平升高可作为血管功能障碍和疾病严重程度的替代指标。

目前本研究存在局限性：一是只分析了相对较小的患者群；二是没有测定其他可溶性内皮细胞标志物，如血管细胞黏附分子-1，细胞间黏附分子-1和P-选择素等。因此，下一步的研究需扩大样本量并分析其他血管内皮损伤标志物，以提供更多的信息。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突