自身免疫性溶血性贫血抗-D自身抗体鉴定及输血一例报道

张德峰 高德珍 于淑红

RHD和RHCE基因由于同源性、相近性和方向相反，可以交换核苷酸从而产生变异等位基因[1]。RH等位基因多态性的存在导致表型的变异。对于有输血或妊娠免疫史的患者，当检出与自身Rh抗原对应的Rh抗体时，很难通过血清学试验区分是自身抗体还是同种抗体[2]。本例报道为一例RhD阳性患者产生抗-D抗体，通过血清学试验联合RH基因分型技术，确定RH等位基因是否有变化，进而判定抗体的性质。

材料与方法

1 临床资料 患者，女，47岁，15年前因头晕、乏力伴茶色尿第一次入住我院，血红蛋白为48 g/L，总胆红素、间接胆红素升高，直接抗人球蛋白试验（direct antiglobulin test，DAT）阳性，骨髓穿刺提示溶血骨髓象。糖皮质激素控制溶血有效，临床诊断为自身免疫性溶血性贫血。交叉配血不合，同型输注B型RhD阳性洗涤红细胞4 U，血红蛋白升至99 g/L。患者院外自服泼尼松治疗，间断复查血常规，血红蛋白维持在90 g/L左右。既往剖宫产术后病史13年余，糖尿病病史8年余。2年前，因乏力加重再次入院，血红蛋白为46 g/L，直接抗人球蛋白试验阳性，不规则抗体筛查试验阳性，抗体鉴定试验提示抗-D抗体。近两年，为提高血红蛋白，反复多次输注RhD阴性红细胞，输注后复查血红蛋白，均提示输注有效。

2 主要仪器与试剂 Ortho Autovue Innova全自动血型分析仪、贝索毛细管离心机、Kubota KA-2200血清离心机、Grifols凝胶卡离心机、Diamed-ID孵育器；IgM型单克隆抗体抗-A和抗-B、抗-D血型定型试剂（批号：20201017、20210115）均购自上海血液生物医药有限责任公司，反定型细胞及不规则抗体筛选细胞（批号：A473Z、3SS0072）、血型卡及抗筛卡（批号：ABR245J、AHC209J）均购自奥森多临床诊断（英国）有限责任公司，抗人球蛋白检测卡（批号：21050.01.1）购自盖立复诊断股份有限公司，16系抗体鉴定谱细胞及IgM型单克隆抗体抗-K（批号：8000453845、8000254004）均购自荷兰三昆试剂有限公司，人类红细胞RHD血型基因分型试剂盒及RHD外显子测序试剂盒（批号：20210401）由江苏中济万泰生物医药有限公司提供，0.2M 2-巯基乙醇（2-mercaptoethanol，2-Me）试剂由本实验室配制。

3 血型鉴定及DAT 全自动血型分析仪检测血型。毛细离心管分离出患者新生红细胞，配制成3%的红细胞悬液，手工加入血型卡中，离心检测ABO及Rh血型抗原，并做试管法DAT。

4 不规则抗体筛查及抗体鉴定 微柱凝胶法及盐水试管法进行不规则抗体筛查试验，微柱凝胶法进行16系谱细胞抗体鉴定。0.2M二巯基乙醇（2-Me）处理RhD抗原阳性的谱细胞后，加入患者血浆进行间接抗人球蛋白试验，并选用处理前K抗原阳性的谱细胞加入抗-K抗体作为对照试验。

5 吸收放散试验 选用B型RhD抗原阴性的献血者红细胞，参照文献[3]以及文献[4]报道的方法进行吸收试验。分离吸收后上清用于测定抗体效价。红细胞洗涤后放散，吸收后放散液进行抗体鉴定。

6 交叉配血 与B型RhD抗原阴性的献血者红细胞，分别以微柱凝胶法、试管法、聚凝胺法进行交叉配血试验。

7RHD基因检测 抽取患者抗凝全血，血样外送至江苏中济万泰生物医药有限公司，按人类红细胞RHD血型基因分型试剂盒说明书，采用荧光PCR法进行RHD基因检测。按RHD外显子测序试剂盒说明书，进行RHD外显子测序。

结 果

1 血型鉴定及DAT 全自动血型分析仪检测血型为B型、RhD阳性。近心端细胞柱凝集法血型鉴定为B型RhD阳性，ccEE，见表1。DAT阳性：AHG 1+，IgG 1+，C3d 1+。

表1 血型鉴定结果

2 不规则抗体筛查及抗体鉴定 抗人球蛋白卡显示，不规则抗体筛查1号筛选细胞1+，2号筛选细胞2+，3号筛选细胞阴性。盐水法1号、2号、3号筛选细胞均为阴性，自身阴性，见表2。患者血浆及放散液抗体鉴定结果符合抗-D格局，与15号谱细胞反应效价为8，自身对照3+s，见表3。按文献[5]报道的方法，采用0.2M 2-Me处理RhD抗原阳性的谱细胞，处理后的谱细胞与患者血浆抗体反应为阳性，对照阴性，排除抗-LW抗体[6]。

表2 不规则抗体筛查结果

表3 抗体鉴定结果

3 吸收放散试验 吸收后放散液抗体鉴定谱细胞全为阴性，吸收后血浆抗-D抗体效价仍为8，患者血浆抗-D抗体未被RhD抗原阴性红细胞吸收。

4 交叉配血 患者血浆与B型RhD抗原阴性的献血者红细胞进行交叉配血试验，盐水法、微柱凝胶法、聚凝胺法主侧均为阴性，提示主侧配血相合。本次入院共输注RhD阴性去白悬浮红细胞4 U，血红蛋白由32 g/L升至56 g/L，临床提示输注有效。

5RHD基因检测RHD基因分型结果显示，该患者RHD荧光分型E1-E7、E9-E10为阳性，见表4。RHD测序结果显示，第2外显子150T＞C杂合、178A＞C杂合、201G＞A杂合、203G＞A杂合及307T＞C杂合，该患者基因型为RHD*D-CE（2）-D/RHD*01，见表5。

表4 RHD基因分型结果

表5 RHD外显子测序结果

讨 论

基因分型是一种预测Rh表型的可靠的方法，并可以确定大多数RHD和RHCE变异等位基因以及RHD合子性[7]。RHD测序结果显示患者基因型为RHD*D-CE（2）-D/RHD*01。RHD*01是国际输血协会（international society of blood transfusion，ISBT）命名的标准的RHD等位基因，可表达正常的RhD抗原。RHD*D-CE（2）-D等位基因[8]，ISBT命名为RHD*03.02或RHD*DⅢb，相对于标准的RHD等位基因（RHD*01），其核苷酸改变位点为150T＞C，178A＞C，201G＞A，203G＞A，307T＞C。虽然RHD*D-CE（2）-D/RHD*01携带变异等位基因RHD*DCE（2）-D，但由于RHD*01的存在，仍可表达正常的D抗原。因此，患者体内产生的抗-D抗体为自身抗体。

严重的自身免疫性溶血性患者常能检出类同种自身抗体（autoantibodies mimicking alloantibodies），简称为类抗体，是一种针对自身抗原的具有同种抗体特异性的自身抗体[9]。大多数类抗体是针对Rh抗原，如抗-C+e，抗-e，抗-C，抗-D。MIZUNO等[10]、陆荣等[11]、BERCOVITZ 等[12]报道RhD抗原阳性的AIHA患者，产生单一抗-D抗体的案例，给予输注RhD抗原阴性的红细胞，输注有效。目前，对于类抗体患者是否输注相应抗原阴性红细胞尚存争议[13]，如果相应抗原阴性的献血者罕见，则难以获得满意配型的红细胞。而且，选择相应抗原阴性的红细胞输注，有可能因非同型输注而暴露于阳性抗原，进而产生同种抗体。类抗体是一种自身抗体，而非同种抗体，也可选择抗原阳性的红细胞进行输注。

总之，对于检出自身Rh抗原对应的Rh抗体的患者，可依靠Rh血型基因分型技术，区分抗体的性质，有助于制定合适的输血方案。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突