基于AIHA的淋巴细胞亚群及Ca2+-calcineurin-NFAT信号通路的研究进展*

姜浩 李丽玮 李志强

自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune hemolytic anemia，AIHA）是一种获得性自身免疫性疾病，在世界范围内每年的发病率约为（1～3）/10万人[1]。尽管AIHA的发病率相对较低，但该病进展较快，短时间内即可出现危及生命的贫血，病死率高达11.2%。AIHA发病的特征为患者产生针对红细胞的自身抗体，导致红细胞在血管外被组织巨噬细胞破坏，寿命大幅度缩短[2]。根据是否存在促进免疫失调的潜在疾病（如淋巴瘤、白血病等），AIHA可分为原发性和继发性；根据抗红细胞抗体的最佳反应温度，AIHA可分为温抗体型、冷抗体型等。AIHA的最常见类型是温抗体型（warm AIHA，wAIHA），此型约占所有AIHA病例的80%，其发病机制主要是免疫球蛋白G（IgG）所致，其红细胞抗体最佳反应温度为37℃。AIHA患者通常出现皮肤甲床苍白、疲乏无力、呼吸过快、心动过速等贫血相关临床表现，伴随黄疸、肝脾肿大、感染等症状与体征[3]。目前，根据英国血液病学会的共识[4]，AIHA的主要治疗方法包括应用肾上腺皮质激素、免疫抑制剂（如环磷酰胺、环孢素A等）、生物制剂（如利妥昔单抗等）以及输血、脾切除等，但这些疗法均有较为显著的副作用。使用肾上腺皮质激素（如甲基强的松）时，随着给药时间及剂量的增加，可能出现一系列肾上腺皮质激素的副作用，如高血压、糖尿病、体重增加、骨质疏松症、胃肠道溃疡、免疫抑制、白内障及焦虑症等[5]。同时，使用激素治疗后达到完全或部分缓解的患者，其中近50%会在一年内出现复发[5]。同时，二线疗法脾切除亦有诸多副作用，AIHA患者脾切除术后的缓解率明显低于自身免疫性血小板减少症（ITP）患者，并且存在脾肿大的患者行脾切除术后形成门静脉血栓的风险较高，此外还可能出现暴发性感染如肺炎链球菌败血症[6-7]。使用免疫抑制剂治疗后可发生严重中性粒细胞减少症并伴有感染、肝肾功能不全等副作用。输血治疗对AIHA患者来说可谓是“双刃剑”，该疗法虽然能够改善贫血，但患者血液中的抗红细胞自身抗体可与输注的红细胞结合，从而破坏输注的红细胞，甚至导致患者贫血症状加重。近年来，利妥昔单抗（Rituximab）被推荐作为wAIHA的二线疗法及冷凝集素型溶血性贫血（CAD）的一线治疗方法。同时，也建议使用利妥昔单抗治疗难治性及复发性AIHA，以获得更高的缓解率。利妥昔单抗是针对B细胞表面蛋白CD20的单抗，其与B细胞表面CD20抗原的结合导致B淋巴细胞凋亡，抑制B细胞介导的致病性自身抗体的产生，从而减少红细胞的破坏；另一方面，利妥昔单抗还降低了抗原呈递细胞（APC）对致病性自身反应性T细胞的反应，从而阻止B细胞与T细胞的相互作用，阻止AIHA致病过程的进一步发展[8]。因此，与其他治疗相比，利妥昔单抗具有更高的治疗缓解率；同时因单抗具有靶向治疗的特性，其不良反应较轻，能够有效减少激素的使用剂量及其伴随的副作用[1]。

尽管应用生物制剂对AIHA进行靶向治疗有着广阔的前景，但AIHA的发病机制目前仍未明确，其涉及自身抗原，致病性抗体，补体系统、T细胞和B细胞异常，以及多克隆淋巴细胞的活化和多种细胞因子产生等多个病理过程。越来越多的研究发现，特定的淋巴细胞亚群及其细胞因子与AIHA的发病机制密切相关[9-11]，这些可能会成为生物制剂的作用靶点。因此，有必要进一步明确与AIHA发病密切相关的淋巴细胞亚群及细胞因子，重新评估其在AIHA疾病进程中发挥的作用，以便探索更多的药物作用靶点。本文主要阐述B淋巴细胞、T淋巴细胞亚群及其细胞因子和Ca2+-calcineurin-NFAT通路与AIHA发病机制的相关性。

1 B淋巴细胞与AIHA的相关性 B淋巴细胞在AIHA的发病中起主要作用，它们产生针对红细胞抗原的致病性自身抗体。大多数AIHA为温抗体型，抗体主要为IgG类[1]。IgG自身抗体通过抗体依赖性细胞毒性作用（ADCC）破坏红细胞，该作用由单核-巨噬细胞系统驱动。巨噬细胞表面存在IgG Fc区表面受体，通过与IgG Fc片段结合介导对红细胞的吞噬，由此导致溶血性贫血的发生[9]。在自身免疫性疾病中，B细胞对自身抗原的反应是通过诱导和增强外周淋巴器官的生发中心（GC）反应进行的[12-13]。在GC中激活的抗原特异性B细胞会经历克隆扩增、B细胞受体细胞突变、抗体亲和力成熟和类别转换（从IgM、IgD转变为同种抗体IgG、IgA、IgE），最终分化为浆细胞和记忆B细胞[14]。这些过程促进了针对红细胞抗原的致病性自身抗体产生，造成红细胞破坏，从而导致了AIHA的发生。除了在产生和分泌自身抗体中发挥作用外，B细胞还通过产生炎性细胞因子并充当抗原呈递细胞（APC）使T细胞活化，推动免疫介导AIHA的发病过程[15]。

2 T细胞亚群与AIHA的相关性

2.1 CD4+Th1/Th2细胞：根据分泌的标志性细胞因子干扰素-γ（IFN-γ）和白细胞介素-4（IL-4）等，Th细胞可分为Th1和Th2细胞亚群[15]。Th1细胞能够分泌白介素12（IL-12）、干扰素-γ（IFN-γ）和肿瘤坏死因子-β（TNF-β），进而激活巨噬细胞、诱发迟发型超敏反应和清除胞内病原体。Th2细胞能够分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13，这些炎症因子具有激活体液免疫、促进抗体生成的作用[17]，提示Th2细胞可能在各种自身抗体介导的疾病（如AIHA）的发展中发挥促进作用。与健康对照者相比，AIHA患者的IFN-γ和Treg水平降低导致对Th2反应的抑制作用降低，从而导致自身抗体介导的自身免疫性疾病的发展[18]。FAGIOLO E等的研究发现，与健康对照组相比，AIHA患者IL-4的基础合成水平增加，IFN-γ水平降低，Th1细胞因子减少，Th2细胞因子增加，Th1/Th2淋巴细胞比例失衡，从而促进了AIHA的发生发展。该研究同时也发现Th1细胞因子减少、Th2细胞因子增加所致的AIHA自身抗体产生可能继发于IL-10/IL-12比例失衡[19]。另外，在AIHA患者中发现了IL-12的水平下调以及IL-10/IL-12比例失衡[20]。这些与AHMAD E等的研究结果相一致，他们也认为IL-10/IL-12比例失衡可能在AIHA的发生和/或维持中发挥重要作用[21]。

2.2 Th17细胞：Th17细胞是由初始CD4+T细胞在IL-23和IL-1β的刺激下分化而来，是特异性免疫刺激反应中产生IL-17的主要细胞。Th17细胞产生IL-21、IL-22，以及它的标志性细胞因子IL-17A和IL-17F[22]。XU L等的研究发现在AIHA患者中Th17细胞数量增加，与疾病活动度密切相关，与抗红细胞IgG抗体水平、乳酸脱氢酶（LDH）活性呈正相关，与血红蛋白、血清补体C3呈负相关。在AIHA小鼠模型研究中，Th17细胞亦与AIHA的发生发展密切相关。Th17细胞的过继转移增强了抗小鼠红细胞抗体反应并促进AIHA的发作，而体内应用抗IL-17的中和抗体能够抑制该疾病的发生发展[23]。MEIKE MITSDOERFFER等发现在与Th17细胞和抗原共培养的条件下，B细胞的增殖明显增加，并且Th17细胞能够促进生发中心（GC）的产生[22]。另外，Th17细胞能诱导B细胞增殖、浆细胞生成，以及促进抗体类别转换，导致AIHA的病理性进展[22]。Th17细胞产生的IL-17和IL-21均能诱导向IgG抗体的类别转换[22]。有报道称IL-17本身不会诱导B细胞增殖[24]，而是IL-21在CD4+T细胞和B细胞的协同作用下诱导了B细胞的扩增和浆细胞的生成。因此，在Th17细胞存在的情况下，B细胞增殖明显增加可能是由于Th17细胞大量产生IL-21所致 。

2.3 CD4+CD25+调节T细胞：CD4+CD25+调节T细胞（CD4+CD25+Treg）是由初始CD4+T细胞分化而来的调节性T细胞，主要起免疫抑制作用。它的主要表型特征为细胞表面表达CD4、CD25（白介素2受体α链）以及组成性表达转录因子Foxp3。CD4+CD25+调节T细胞在外周耐受的产生和维持中发挥重要作用，可阻止AIHA及其他多克隆自身免疫性疾病的发生[25]。Treg细胞发育异常或功能失调是多种自身免疫性疾病的免疫特征，AHMAD E等发现AIHA患者的循环血中CD4+Treg细胞降低[21]。AMINA MQADM等的研究发现在Playfair和Marshall-Clarke小鼠AIHA模型[26]中，耗竭CD4+CD25+Treg细胞可将AIHA的发病率从30%提高至90%。然而，在过继转移CD4+CD25+Treg细胞的小鼠中，自身抗体的产生被完全抑制[11]。

2.4 TFH/TFR细胞：滤泡辅助T细胞（TFH）是高度特异性的CD4+淋巴细胞亚群，在小鼠、人类和非人类灵长类动物中被鉴定为CXCR5hiPD1hiBcl6hiCD4+T细胞。TFH细胞的特征在于表达转录因子B细胞淋巴瘤6蛋白（Bcl-6）、趋化因子受体CXCR5、诱导型共刺激物（ICOS）、细胞死亡蛋白1（PD-1）和产生高水平的白介素21（IL-21）。其主要功能是支持生发中心（GC）的形成和反应，为B细胞提供必需的成熟信号，驱动抗体类别转换，促进自身抗体的异常产生并促进免疫记忆形成[27]。

YUHAN GAO等研究发现TFH在诱导AIHA中起重要的促进作用[10]。IL-21是TFH细胞分泌的主要细胞因子，影响B细胞的增殖、存活和同种型转换，为B细胞和TFH细胞提供双向促进信号[28]。另外，IL-21可诱导浆细胞分化，免疫球蛋白产生和免疫球蛋白向IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3的类别转换[22]。因此，通常TFH细胞的存活和功能发挥必须依赖IL-21。ICOS在CD4+TFH细胞分化过程中高度表达，是上调Bcl-6的表达和TFH细胞分化程序中控制Bcl-6所必需的。Bcl-6是CD4+TFH的主要调节因子，控制CD4+T细胞中下游的CXCR5表达，从而建立了TFH细胞从ICOS、Bcl-6到CXCR5分化的分子层次，即ICOS信号诱导Bcl-6表达，随后诱导CXCR5高表达[29]。趋化因子受体CXCR5的表达使TFH迁移到B细胞滤泡和生发中心富含CXCL13的区域，从而刺激活化的B细胞成为长寿命、分泌抗体的浆细胞或记忆B细胞[30]。IL-6和IL-21通过信号转导子和转录激活子3（STAT3）上调Bcl-6和CXCR5的表达，此途径在TFH细胞的分化和功能维持中发挥关键作用[31-32]。

滤泡调节T细胞（TFR）代表高度专业化的Foxp3+Treg细胞的亚群，TFR细胞的特征在于表达CXCR5、PD-1、ICOS、CTLA-4和转录因子Foxp3、Blimp1、Bcl-6。TFR细胞的功能可分为维持自我耐受和促进有效的体液反应[33]。DAVIDE BOTTA等的研究表明，在没有TFR细胞的情况下，流感病毒感染模型中会出现自身反应性抗体分泌细胞。这表明TFR细胞的功能之一是防止自身反应性B细胞克隆的扩增，维持有效的体液反应[34]。RACHEL L CLEMENT等研究发现缺乏TFR细胞的小鼠血清中存在自身反应性IgG和IgE[35]，也证明了TFR细胞在体液反应中发挥的积极作用。但是目前对于TFR细胞如何促进有效的体液反应尚未研究透彻。在自身免疫性疾病如儿童免疫性血小板减少症患者血中观察到TFR/TFH比例失衡，外周血TFR细胞比例减少、TFH细胞比例增加[36]。TFR细胞具有抑制TFH激活和产生细胞因子的能力，并且能通过CTLA-4的高表达以及产生抑制性细胞因子如IL-10、转化生长因子β（TGF-β）来抑制生发中心的B细胞GL7和B7-1表达以及限制类别转换重组[37-38]。因此，TFR细胞通过抑制TFH激活和细胞因子的产生、抑制生发中心B细胞激活及限制类别转换重组，在维持免疫系统稳态及阻止AIHA的发生发展中发挥重要作用。另外，YUHAN GAO等研究发现在AIHA小鼠模型中，TFH/TFR的比例增加，血清IL-21和IL-6水平升高，以及Bcl-6和c-Maf表达上调[10]。

3 Ca2+-calcineurin-NFAT通路与AIHA的相关性 活化的T细胞核内因子（nuclear factor of activated T-cells，NFAT）家族在T细胞的细胞因子基因表达中发挥着关键作用。NFAT转录因子家族有5个家族成员：NFAT1（NFATc2或NFATp）、NFAT2（NFATc或NFATc1）、NFAT3（NFATc4）、NFAT4（NFATx或NFATc3）和NFAT5，其中NFAT1-4是由Ca2+信号调节的，由钙/钙调素依赖性磷酸酶定位至细胞核[39]。抗原激活T细胞后，细胞内钙水平升高，钙调神经磷酸酶（calcineurin）随之被激活。这种丝氨酸/苏氨酸磷酸酶通过其去磷酸化激活胞质NFAT，从而使得活化的NFAT移位至细胞核，NFAT差异性地调节T细胞发育、活化和分化相关基因的表达，同时产生不同的炎性细胞因子[40-41]。近年来，在自身免疫性疾病中，Ca2+-钙调神经磷酸酶-NFAT1-4通路失调方面已有相关报道。钙调神经磷酸酶抑制剂，环孢菌素（CsA）和他克莫司已被用于治疗诸如系统性红斑狼疮（SLE）和类风湿性关节炎（RA）等自身免疫疾病[42]。

RENGARAJAN J等的研究发现，缺乏NFAT2的小鼠表现出IL-4和Th2细胞因子的产生受损，IgG1和IgE水平降低[43]，提示NFAT2途径可能在AIHA的发病中发挥作用。NFAT1和NFAT2都能够直接与IL-17启动子区结合[44]。CD4特异性NFAT2缺陷小鼠中IL-17表达降低，NFAT1和NFAT2缺陷小鼠（DKO）中IL-17表达也降低[45]，且NFAT1能够直接结合IL-10、IL-17基因座的远端调节区。因此，NFAT1的过度活化及对钙调神经磷酸酶的亲和力增加，能够使IL-10和IL-17的产生增加[46]。此外，CD4+特异性NFAT2缺陷小鼠表现出RORγt水平降低，而RORγt是Th17的主要转录调节因子，故NFAT2水平降低导致IL-17A、IL-17F和IL-21产生减少[47]。TFH细胞和生发中心B细胞均表达高水平的NFAT1和NFAT2，缺乏NFAT2的T细胞IgG1和IgE水平降低，表明NFAT家族在体液免疫中的功能重要性。此外，NFAT调控一些分子的表达，如干扰素调节因子4（IRF4）、PD-1和 CXCR5，这些分子对于TFH细胞的功能和分化至关重要[48]。同时，NFAT是IL-21产生所必需的转录因子，IL-21对TFH的分化和功能发挥有重要作用，这一过程能够被环孢素A阻断[49]。在淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染模型中，缺乏NFAT1/2小鼠表现出TFH细胞分化受损[50]。因此，NFAT是生发中心TFH细胞分化和功能形成必不可少的因子，在AIHA的致病中也发挥着重要作用。

总之，淋巴细胞亚群及其产生的细胞因子和Ca2+-calcineurin-NFAT通路在AIHA中发挥重要的作用。但它们发挥作用的诸多途径仍未完全明确。为了增加治疗途径、提高治疗效果，应对影响AIHA致病性自身抗体产生的因素、疾病进程中相关的淋巴细胞亚群及其细胞因子的作用途径、Ca2+-calcineurin-NFAT相关信号通路进行深入研究，以发现更多的治疗靶点。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突