RhD阴性孕妇的产前同种免疫分析及围产期新生儿溶血病的监测和预防

陈阳

胎儿与新生儿溶血病（hemolytic disease of the fetus and newborn，HDFN）是母亲与胎儿红细胞血型不合引起的同种被动免疫性疾病。已发现多种红细胞血型系统的抗体可引起HDFN，其中ABO血型不合者多见，其次为Rh血型不合，MNS、Kell及Kidd等血型少见，Rh系统抗-D抗体所致的HDFN最为严重。在我国，RhD阴性人群的比例约为0.3%～0.5%，每年约有一万余例RhD阴性孕产妇，是个不容忽视的群体[1-2]。笔者对596例孕妇夫妇进行ABO血型及RhD抗原检查，孕妇进行抗体筛选及鉴定。为了解RhD阴性孕妇产生抗-D抗体发生同种免疫的状况，为临床诊断、治疗Rh新生儿溶血病提供理论和实践依据，初步探讨RhD阴性孕妇个体的分子生物学基础上的特征，为指导RhD阴性孕妇进行RhD免疫球蛋白干预治疗提供初步的理论依据。

材料与方法

1 研究对象 以2017年1月～2020年12月在辽宁省血液中心进行新生儿溶血病产前检查的596例孕妇为研究对象。这项研究获得辽宁省血液中心伦理委员会的批准。

2 主要试剂及仪器 抗-A、-B血型定型试剂、人ABO血型反定型红细胞、抗人球蛋白试剂、筛选细胞、谱细胞、抗-C、抗-c、抗-E和抗-e试剂均为上海市血液中心生物医药有限责任公司提供；IgM抗-D试剂（Seraclone，Bio-Rad Medical Diagnostics GmbH Industriestrabe 163303 Dreich，Germany）；TIANamp Blood DNA Kit、GoTaq® Green Master Mix（Promega公司）、DEL特异性引物序列由TaKaRa公司合成、天津秀鹏人类红细胞RHD血型部分D基因检测试剂盒。凝胶成像仪（Enduro GDS Touch）。

3 方法

3.1 ABO血型及RhD抗原检测：实验室检查方案符合中国输血协会免疫血液学专业委员会专家组制定的《胎儿新生儿溶血病的实验室检测专家共识》[3]。所有孕妇在妊娠8～12周建档进行ABO和RhD血型鉴定，红细胞不规则抗体筛查。抗体筛查阳性进行抗体鉴定。ABO正反定型和RhD抗原检测按照文献[4]试管法操作。IgM抗-D试剂检测阴性样本，检测孕妇RhC、c、E、e抗原。

3.2 抗体筛选及鉴定：抗体筛选方法见文献[4]，对抗体筛选阳性个体用10个O型谱细胞（上海市血液中心生物医药有限责任公司）进行抗体鉴定，抗-D效价检测采用间接抗人球蛋白法。抗体检测时机与频次按照中国医师协会输血科医师分会发布《新生儿溶血病免疫血液学试验推荐方案》[5]及2017年专家协作组《RhD抗原阴性孕产妇血液安全管理专家共识》[6]标准进行检测。

3.3 亚洲型DEL（RHD*01EL.01）检测：DEL特异性引物序列[7]，特异扩增RHD*01EL.01等位基因，产物长度为867 bp；人生长激素基因429 bp的引物作为内对照。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后94℃变性30 s、58℃退火30 s和72℃延伸50 s，循环30次，最后72℃延伸5 min产物通过2%琼脂糖凝胺电泳，拍照观察结果，并进行RHD血型部分D基因检测。

3.4 Rh免疫球蛋白（RhIG）用药指征及注射时间：RhD阴性孕妇，丈夫为RhD阳性时，胎儿就有可能是RhD抗原阳性，孕妇有致敏的风险，成为RhIG预防治疗的候选人[8]。未产生抗-D的RhD阴性孕妇注射抗-D免疫球蛋白采用28周的单剂量1 500 IU方案或28周和34周的双剂量各500 IU方案均可，同时监测注射后抗-D水平；分娩后新生儿脐血检测RhD阳性，产妇产后72 h内再注射1次≥500 IU 抗-D免疫球蛋白，越早越好[9]。产妇做胎母输血综合征（fetomaternal hemorrhage，FMH）检测，并根据试验结果决定是否追加注射；RhD阴性孕妇孕期行绒膜绒毛取样、羊水穿刺、胎儿侵入性操作、创伤或者阴道流血后，也应于72 h内完成肌内注射。对孕产妇履行告知可能风险，知情同意后，医生开具处方进行注射。

3.5 胎儿及新生儿溶血病监测：产生抗-D抗体的孕妇于胎儿娩出后进行新生儿血样或胎儿娩出后采集脐带血进行血型、Hb、胆红素测定、直抗、游离抗体试验、释放试验。

结 果

1 ABO血型及RhD抗原检测结果 596例孕妇中，O型542例，A型21例，B型25例，AB型8例；RhD阳性526例，70例IgM抗-D检测为阴性。

2 抗体筛选及鉴定结果 70例血清学RhD阴性孕妇中，有43例为初次妊娠，27例为妊娠次数在两次及以上。初次妊娠孕妇均未产生抗体，27例多次妊娠史孕妇中，6例产生抗-D抗体，产生抗体比例为8.57%，6例产生抗-D抗体孕妇均有妊娠史、孕产史、无输血史。具体检测结果见表1。

3 亚洲型DEL（RHD*01EL.01）检测结果 70例RhD抗原阴性孕妇采用PCR-SSP方法检测亚洲型DEL（RHD*01EL.01），即检测RHD*1227A等位基因。其中含有RHD*1227A等位基因18例，RHD*1227A等位基因阴性52例。6例产生抗-D抗体孕妇均未检测到RHD*1227A等位基因。18例含有RHD*1227A等位基因样本中抽取4例采用天津秀鹏人类红细胞RHD血型部分D基因检测试剂盒进行验证，结果全部相符，电泳结果见图1。

图1 亚洲型DEL（RHD*01EL.01）基因型检测结果

4 RhIG治疗 64名未产生抗-D抗体RhD阴性孕妇，其丈夫均为RhD阳性。初次妊娠37名，多次妊娠27名，母儿Rh血型不合58名孕妇在孕28周、34周、分娩时复查抗-D抗体，未致敏的妊娠，采用28周的单剂量1 500 IU方案或28周和34周的双剂量各500 IU方案均可，同时监测注射后抗-D水平；分娩后新生儿脐血检测RhD阳性，产妇产后72 h内再注射1次≥ 500 IU抗-D免疫球蛋白。28周孕前检查出抗-D致敏的6名孕妇，也使用抗-D免疫球蛋白制剂1 500 IU以阻断抗-D免疫应答发生。

5 胎儿及新生儿溶血病检测 6例RhD阴性孕妇产生胎儿D血型均为阳性，直抗阳性，其中5名胎儿未发生HDFN。样本1孕妇抗-D效价64，胎儿脐带血游离试验和释放试验阳性，证实抗-D引起新生儿溶血病。胎儿进行换血治疗，效果良好。

讨 论

本研究70例RhD抗原阴性样本中，多次孕产史为RhD阴性女性对D抗原致敏的主要诱因，RhD阴性孕妇中6例产生抗-D抗体，8.57%孕产妇对D抗原致敏并产生IgG抗-D。6例产生抗-D抗体孕妇都排除亚洲型DEL，与我们之前调查结果一致，即产生抗-D抗体的被检者都不是DEL型，DEL型的被检者未产生抗-D抗体[10-11]。因胎龄8周左右的胎儿红细胞上即可检出Rh抗原，孕妇的同种免疫常发生在第2胎及以后，孕妇在生育第1胎时，胎儿血进入母体，造成初次免疫，在二胎时，胎儿血液再次进入母体，刺激母体免疫系统的回忆反应，从而产生抗-D抗体。所以多次妊娠和生育RhD阳性胎儿，会刺激孕妇产生抗-D抗体。6例产生抗-D抗体孕妇中，5例为二胎，1例妊娠5次，均无输血史，因此6名孕妇产生抗-D抗体与多次妊娠和生育RhD阳性胎儿有关。6例产生抗-D抗体孕妇，孕12周后对抗-D抗体水平进行监测，结合孕妇抗体效价和胎儿大脑中动脉的超声结果评估胎儿的贫血状况。抗人球蛋白（AHG）方法的抗-D临界值为16，低于此效价时认为HDFN和胎儿水肿发生风险较低且不需要进行侵入性干预。

血型抗体特异性与HDFN发生有一定程度相关性，其中母体中存在抗-D极易引起HDFN的发生甚至胎儿或新生儿死亡[12]。RhD阴性孕妇产前检测到抗-D抗体，即提示新生儿面临发生HDFN的风险。在我国对RhD血型不合所致的HDFN孕妇主要采取监测和支持疗法，缺乏特异性的治疗手段。RhD血型不合所致的HDFN的预防重点在于阻断母体首次建立抗-D免疫应答过程。欧洲国家通过注射RhIG治疗制剂，显著降低了RhD血型不合所致的HDFN发病率[13-15]。美国妇产科学会推荐在妊娠28周进行RhIG治疗，产前RhIG治疗可以将同种免疫概率降至0.1%，而产后RhIG治疗仅可将同种免疫概率降至1.5%[8]。此外，在羊膜穿刺术、脐带穿刺术、流产或腹部创伤后均应进行RhIG治疗。RhD阴性孕妇推荐孕妇外周血游离胎儿DNA（cell-free fetal DNA，cff-DNA）检测以确定胎儿RhD血型基因型，针对性的进行产前预防抗-D免疫球蛋白注射，避免不必要用药，未产生抗-D抗体的孕妇进行cff-DNA检测，可减少孕妇产前检查频次[16]。

HDFN以胎儿及新生儿溶血为主要病理过程，以贫血和新生儿黄疸为主要临床表现的围产期常见疾病。溶血程度与效价值呈正相关，使之产生不同程度的溶血，可引起胎儿贫血、水肿、流产、死胎、早产[17]。对于Rh-HDFN，近20年来抗-D的免疫球蛋白的应用有很大进展，可使发病率和病死率显著下降，母亲的致敏率可从16%下降到2%，而实施28周预防后，致敏率降低到约0.37%；HDFN导致的新生儿死亡率从46/100 000降为1.6/100 000[2]。另外胎儿Rh血型检测对预防HDFN发生具有重要指导意义。如果胎儿为RhD阴性，则不必使用RhIG治疗和产前抗体监测。应用DNA技术无创检测胎儿Rh血型是产前检测的一项可靠技术。RhD阴性孕妇妊娠期发生RhD同种免疫主要采取孕妇血浆置换、胎儿脐静脉输血及注射RhIG等，产后对婴儿主要采用婴儿换血或者光疗法等治疗方案。另外加强围产期宣教和动态监测孕妇抗-D效价，可有效防治HDFN和产后出血，避免同种抗体引起新生儿残疾，提高围产期保健质量。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突