应用流式细胞术对自身免疫性溶血性贫血患者自身抗体掩盖下血型同种抗体检测的研究*

赵俸涌 张玉宇 王中英 徐婷 李勤 张嘉敏 向东 朱自严

临床输血研究中，如何为自身免疫性溶血性贫血（自免溶贫，autoimmune hemolytic anemia，AIHA）患者进行配血与输血是较为困难的问题。首先，由于AIHA患者体内存在的自身抗体会介导患者自身红细胞发生免疫清除，故该类患者往往需要长期接受输血治疗，这大大增加了该类患者产生血型同种抗体的可能性[1]；其次，血清学方法通过血凝反应判读结果，而自身抗体与弱的血型同种抗体在血凝结果上不易区分，导致较弱的同种抗体存在漏检的可能[2]，在临床配血中，如果患者同时具有自身抗体和血型同种抗体，在自身抗体的干扰下，配血难以识别同种抗体的存在[3]，一旦输入与同种抗体不配合的红细胞，将激活免疫系统，使患者的溶血加重，病情恶化[4]。自身抗体对同种抗体的掩盖作用，主要由两方面的因素造成：首先，同种抗体亲和力较高，更多被输入的不配合红细胞消耗，增加了同种抗体的检测难度[5]。其次，在自身免疫性疾病研究中发现，自身抗体通常亲和力较同种异体抗体弱[6]，如果此现象亦存在于自免溶贫，则在输入不配合红细胞后，单位时间内，自身抗体消耗远小于同种抗体，而在血清学方法中，相对比例提高的自身抗体就会进一步增加同种抗体检测的难度。

为应对上述问题，目前一些临床输血检测实验室常采用稀释抗体及吸收自身抗体的方法进行同种抗体鉴定，以增加自免溶贫患者样本中同种抗体的检出率，但前者常存在因稀释作用而导致同种抗体的漏检；后者中，自体细胞吸收方法因受血者体内有近期输入的异体红细胞，而存在同种抗体被吸附的风险，而采用异体细胞吸收也存在吸附自身抗体同时吸附同种抗体。此前，本实验室已应用流式细胞术高敏感度的优势，对血型抗原的个体差异及稳定性进行了相关研究并取得了较为良好的检测结果[7]，在此基础上，拟利用流式细胞术对模拟自身抗体掩盖同种抗体的样本进行检测，并与传统血清学方法进行比较。

材料与方法

1 试验材料 本研究涉及所有样本均经过伦理告知，符合医学伦理。样本均来源于上海市血液中心。

O型红细胞样本（ccDEE，3例；ccdee，3例），效价为64的无特异性人源性自身抗体1例、人源性IgG-D 5例（效价分别为4 096、512、128、256、256），人源性IgG-E 4例（效价分别为128、512、256、256），多人份抗筛阴性新鲜混合AB血浆。

2 试剂与仪器 抗人IgG Fab'荧光二抗Alexa Fluor 647（Jackson，144879），0.3% BSA的PBS（上海源培，G40608），cytoflex流式细胞仪（Beckman，A001-1-1102），伯乐抗人球凝胶卡（Bio-rad，50631.60.17），离心机（久保田，KA-2200），微柱凝胶卡用离心机（久保田，5500）。

3 方法

3.1 AIHA模拟血浆样本的设立：将1例人源性IgG-D、1例人源IgG-E抗血浆分别使用多人份AB血浆，均稀释标定至与自身抗体相同的效价。同种抗体按表1比例倍比稀释后与自身抗体等量混合，制备64效价组自身抗体+混合同种抗体的模拟自免溶贫患者血浆及对照血浆（“64效价组”指同种抗体和自身抗体效价均为64效价）。“32效价组”、“16效价组”由“64效价组”倍比稀释制备。

表1 64效价模拟血浆制备方法（200 μL体系）

3.2 流式细胞仪检测方法：收集新鲜的ccDEE和ccdee的血样，加入含0.3% BSA的PBS，1 000 g，3 min离心洗涤3次，用生理盐水配制3%红细胞悬液。取10 μL红细胞悬液，加入等量的模拟AIHA患者血浆充分混匀，37 ℃致敏30 min；洗涤后每管加入荧光二抗50 μL（抗人IgG Fab'荧光二抗Alexa Fluor 647，按照说明书溶解后，1∶50稀释应用），室温孵育25 min ；洗涤，1 mL PBS重悬，进行流式检测。记录单个红细胞（流式圈门逻辑中的P3门内细胞）的平均荧光强度（MFI值）。

3.3 凝胶卡法：伯乐抗人球凝胶卡中，20 μL 3 %红细胞悬液，加20 μL模拟血浆，37℃孵育15 min，离心，观察凝集强度并评分记录，凝胶卡法评分标准为本室参考标准，见图1。

图1 微柱凝胶卡检测评分表

3.4 验证流式检测AIHA模拟血浆效果稳定性：选取流式方法检出下限对应的AIHA模拟血浆组（使用-D和-E作为同种抗体组分，效价为64、32、16），采用3.1中方法，另使用不同的人源性抗-D（4例）与抗-E（3例）同种抗体，配制模拟血浆；再分别按照方法3.2、3.3进行检测。

4 数据统计与绘图 本研究使用IBM SPSS 22.0对原始数据进行统计分析与绘图。在流式检测模拟AIHA血浆实验中，对模拟血浆与对应抗原阳性、阴性细胞的流式检测结果采用配对t检验进行分析（见结果1），对抗原阴性细胞与模拟血浆的检测结果，采用独立样本t检验进行核验以保证结果的准确性（见结果1）；流式方法和凝胶卡法比较实验中，两种方法间比较结果采用配对t检验分析（见结果3）。

结 果

1 流式检测模拟AIHA血浆结果 64效价组中，各组自身抗体与不同稀释度的同种抗体（抗D或抗E）混合，制备模拟AIHA血浆，并使其与相应抗原阳性的红细胞反应。当同种抗体占同效价自身抗体1/2～1/16时，结果（MFI）均与阴性对照（仅自身抗体）存在明显差异，配对t检验P＜0.05，结果具有统计学意义。而平行抗原阴性细胞对照实验，MFI值为1 238±189（n=7），独立样本t检验P＞0.05，即抗原阴性细胞反应不受加入的同种抗体影响。

以上结果显示，在“64效价组”中，流式方法最低检测限为占自身抗体1/16（同效价体积比）的混合同种抗体。

按同样方法，检出并验证了“32效价组”和“16效价组”中，流式方法可检出对仅占自身抗体1/8（同效价体积比）混合比例的模拟AIHA血浆中的同种抗体。并且两个效价组中，抗原阴性细胞反应不受加入的同种抗体影响。

综上，流式方法对自身抗体掩盖下的同种抗体最低检测限（可检出同种抗体的最大自身抗体∶同种抗体稀释比）为：64效价组：16∶1稀释；32效价组：8∶1稀释；16效价组：8∶1稀释。

流式检测结果示意见图2 DE。

图2 流式检测图（32效价组模拟血浆（抗-D同种抗体））

2 血清学方法检测模拟AIHA血浆结果 64效价组中，传统血清学方法在自身抗体：同种抗体为1∶1～4∶1时，可检出同种抗体的存在，检测下限为4∶1；在32效价组和16效价组中，传统血清学方法同样检出下限均为2∶1。检测结果示意见图3。

图3 Bio-rad抗人球凝胶卡检测模拟AIHA患者血浆结果示意图

3 比较流式方法和凝胶卡法 经过数据统计与分析，各效价组中，流式方法检出下限均为微柱凝胶卡法的4倍（P≤0.05）（见图4A-C）。流式方法检出自身抗体掩盖下的同种抗体敏感度更高。

为验证流式方法检出下限稳定性，又经过材料与方法3中使用不同的人源性抗-D（4例）与抗-E（3例）同种抗体配制共7份模拟血浆进行验证，3个效价组中仍均能在前述最低检出限中（64效价同种抗体：自身抗体，16∶1；32效价/16效价，8∶1）检出同种抗体（P≤0.05）（见图4D）。流式方法检出自身抗体掩盖下的同种抗体检测效果具有高敏感度和稳定性。

图4 流式方法与抗人球凝胶卡法检测敏感度比较

讨 论

自身抗体是机体针对自身组织，器官、细胞及细胞成分的抗体[8]。正常人体内低效价的自身抗体参与了衰老细胞清除等机制，当机体自身抗体的效价超过阈值，就可能对自体器官组织进行攻击，造成损伤，诱发疾病。高效价自身抗体多发于免疫功能紊乱、移植及肿瘤患者[9]。虽然对自免溶贫患者自身抗体的产生机理尚未彻底阐明，但有研究表明，自身抗体与B细胞的突变有关，突变的B细胞产生了异常糖基化，这些异常糖基化的抗体可识别自身抗原[10]。

在输血领域中自身抗体对于患者血液输注带来了极大挑战，一方面，自身抗体通常会导致自身红细胞被病理性清除，导致血红蛋白降低，极大威胁患者健康及生活质量[11-12]；另一方面，此类病患对于贫血的缓解高度依赖红细胞输注治疗，而病患的自身抗体会造成直抗和间抗阳性，导致配血不合；自身抗体还会导致在抗体筛查及鉴定过程中对同种抗体的掩盖，导致同种血型抗体的漏检几率大大增加[13-14]。

目前实验室通常采用的传统血清学方法对此类患者样本进行抗体鉴定与配血，其中交叉配血实验是保障输血安全的最后关卡，在临床配血实验中凝胶卡方法是敏感度、准确度及稳定性最高的方法之一。在血清学方法检测过程中，由于自身抗体与同种抗体均产生凝集，因此必然会发生相互干扰的现象。在流式细胞术检测中，自身抗体与同种抗体均以荧光量作为标记，单纯自身抗体与不同红细胞结合能力几乎相同，产生免疫荧光相近，但在自身抗体混合同种抗体的情况下，存在的同种抗体将与对应抗原阳性细胞反应，产生免疫荧光的叠加，最终导致免疫荧光值高于抗原阴性细胞，故可更有效地对混于自身抗体中的同种抗体进行检测。

综上所述，在同种抗体被自身抗体掩盖、难以判断抗体特异性的情况下，流式方法能在一定程度上消除同种抗体掩盖效应的影响。从而对配血实验中，患者血浆中是否存在于拟输入红细胞样本抗原发生免疫的血型同种抗体进行检测。确保交叉配血试验中主侧配血结果可靠。

虽然本研究通过多例自身、同种抗体混合体系进行了检测方法的比较，并获得了较好的结果，为临床应用研究提供了基础；但本研究还存在以下一些问题与不足，首先，本研究仅对方法学进行了验证，在临床研究中，对于阴阳性判断的临界值还需要大量临床样本实验总结，这也是未来本研究团队拟进行的研究方向；其次，对于一些具有半衰期较短的血型系统抗体（如Kidd系统血型同种抗体）[15-16]，其血清中抗体含量极低，流式方法对此类抗体的检测能力，还有待进一步验证和研究。此外，本研究涉及的流式体系从理论上还可应用于药物抗体掩盖的同种抗体检测、药物诱导的具有血型特异性的自身抗体的检测，具体效果还有待在未来进一步探索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突