肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响

李全富 夏天 石春薇 陈卓

(1武汉市第三医院普外科，湖北 武汉 430000；2同济医学院病原微生物教研室)

原发性肝癌的全球发病率呈逐年增长趋势，死亡率位居全部恶性肿瘤的第2位〔1〕。我国每年因肝癌死亡的患者数约占全球总死亡数的50%，高复发率和转移率是不良预后的主要原因〔2〕。外泌体是直径在30～150 nm之间的双层膜性囊泡，含有mRNA、蛋白质等多种生物活性物质，其在肿瘤微环境中的作用是目前医学领域的研究热点之一〔3〕。相关研究显示，外泌体在细胞与细胞信号传递中发挥重要作用，也是肿瘤细胞与肿瘤微环境信息交流的载体，在肿瘤发生、发展、耐药产生中发挥重要作用〔4〕。但外泌体在低氧环境下对肝癌细胞的影响仍未明确。本研究旨在探讨肝癌细胞低氧环境下分泌的外泌体对同源细胞活性的影响。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 人肝癌细胞(HHCC)购于上海北诺生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培养基、胰蛋白酶购于维森特生物技术(南京)有限公司；CCK-8试剂盒购于上海宇淳生物有限公司；单克隆抗体CD9、CD63、CD81购于北京启研生物有限公司；Transwell小室购于中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。

1.2HHCC培养 胎牛血清在4℃、1×106r/min条件下恒温离心2 h，室温下静置过夜，次日去除沉淀，得到无外泌体的胎牛血清。使用含10%无外泌体胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2、93%N2、5%O2的细胞培养箱中进行低氧培养。常氧HHCC用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2培养箱中培养。

1.3低氧环境下HHCC细胞上清液外泌体提取 将对数生长期HHCC接种于培养皿中，先使用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基常规培养过夜，光学显微镜下观察HHCC贴壁生长后，更换为含10%无外泌体胎牛血清的RPMI1640培养基，继续培养48 h，从培养上清液中提取外泌体。提取方法：4℃、依次500 r/min 离心20 min，2 000 r/min离心10 min，12 000 r/min离心20 min，收集上清，过滤器(0.22 μm)处理后，4℃、1×106r/min离心2 h，弃去上清，使用磷酸盐缓冲液(PBS)溶液重悬沉淀，再次4℃、1×106r/min离心2 h，沉淀物即为外泌体，使用PBS重悬后-80℃保存待用。

1.4低氧环境下HHCC外泌体投射电子显微镜鉴定 取HHCC细胞外泌体混悬液20 μl，加入5%多聚甲醛20 μl，混合均匀，取10 μl滴于TEM电镜铜网，室温条件下静置30 min；使用PBS洗涤铜网，在网格上滴加5%戊二醛50 μl固定10 min，蒸馏水洗涤，2%醋酸双氧铀做负染色10 min，包被并晾干后在投射电子显微镜下观察并拍照。

1.5Western印迹检测外泌体特异性蛋白表达 取HHCC细胞外泌体混悬液50 μl，RIPA裂解液提取蛋白，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离，将目标蛋白转至硝酸纤维素印迹膜，5%BSA封闭液处理1 h，滴加小鼠抗人CD9、CD63、CD81单克隆抗体，均为1∶500稀释；小鼠抗人GAPDH单克隆抗体，1∶1 000稀释；4℃过夜。杂交膜清洗液洗涤40 min，滴加辣根过氧化物酶标记的二抗，1∶2 000稀释，室温下孵育1 h，电化学发光(ECL)显色，凝胶成像系统检测各条带灰度值。

1.6CCK-8检测细胞增殖能力 将对数生长期HHCC接种于96孔板中，密度为1×104个/孔，常规孵育过夜，弃去培养液，外泌体组每孔加入含低氧环境下HHCC外泌体的RPMI1640完全培养基，空白对照组每孔仅加入RPMI1640完全培养基，每组设置5个复孔，分别培养24、48、72 h，弃去培养液，加入100 μl CCK-8工作液，孵育40 min，上酶标仪读取450 nm处吸光度(OD)值。

1.7细胞迁移能力检测 将对数生长期HHCC接种于6孔板中，密度为3×105个/孔，37℃、5%CO2培养箱中孵育，观察细胞覆盖培养孔90%以上时，用无菌移液枪头进行划痕实验，PBS洗涤3次。外泌体组加入含低氧环境下HHCC外泌体的RPMI1640完全培养基，空白对照组每孔仅加入RPMI1640完全培养基，继续培养12、24、48 h进行拍照测量。

1.8细胞侵袭能力检测 基质胶与培养基按1∶3的比例混合，取50 μl包被Transwell小室底部膜。将对数生长期HHCC接种至Transwell小室，密度为3×104个/孔，外泌体组加入100 μl 含低氧环境下HHCC外泌体的RPMI1640培养基，空白对照组每孔仅加入等体积的RPMI1640培养基；Transwell小室下层加入500 μl 含10%胎牛血清的RPMI1640培养基。继续培养48 h，多聚甲醛固定、结晶紫染色，光学显微镜下随机选取8个视野，记录细胞数并取平均值，每组设置5个复孔。

1.9统计学分析 使用SPSS23.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1低氧环境下HHCC外泌体的获得与鉴定 电子显微镜观察显示，低氧环境下HHCC分泌的外泌体直径为80～130 nm，外观呈椭圆形或圆形，是双层膜包被的囊泡小体。提取HHCC和外泌体中的总蛋白，进行Western印迹分析显示，HHCC中外泌体相关标志蛋白CD9、CD63、CD81的相对表达量分别为0.82±0.08、0.80±0.05、0.74±0.06，符合HHCC自身分泌的外泌体表达特点。提示成功提取了低氧环境下HHCC分泌的外泌体。见图1，图2。

图1 低氧环境下HHCC外泌体电子显微镜下观察(×200)

图2 低氧环境下HHCC外泌体特异性蛋白Western印迹电泳

2.2低氧环境下HHCC外泌体对HHCC细胞增殖能力的影响 培养24 h内，外泌体组与空白对照组OD值差异无统计学意义(P>0.05)；培养48、72 h，外泌体组HHCC OD值明显高于空白对照组(P<0.05)。见表1。

表1 低氧环境下HHCC外泌体对HHCC细胞增殖能力的影响值)

2.3低氧环境下HHCC外泌体对HHCC迁移能力的影响 细胞划痕实验12 h，外泌体组与空白对照组细胞迁移距离差异无统计学意义(P>0.05)；细胞划痕实验24、48 h，外泌体组细胞迁移距离明显长于空白对照组(P<0.05)。见图3，表2。

图3 细胞划痕实验检测两组HHCC的迁移能力(×200)

表2 两组HHCC迁移距离比较

2.4低氧环境下HHCC外泌体对HHCC侵袭能力的影响 培养48 h，外泌体组侵袭至Transwell小室膜下的HHCC细胞数为(116±20)个/高倍镜视野，明显多于对照组的(39±8)个/高倍镜视野，差异有统计学意义(t=27.619，P=0.000)。见图4。

图4 缺氧外泌体对HHCC细胞侵袭能力的Transwell小室实验(×400)

3 讨 论

原发性肝癌是我国发病率和死亡率逐年上升的消化系统恶性肿瘤，其中90%以上为肝细胞癌，增殖、迁移和侵袭能力均较强，且发病早期症状不明显，临床确诊时多数患者已处于中晚期，无法行根治术治疗，5年生存率处于较低水平〔5〕。探究原发性肝癌发生与进展的分子机制，对研发新的治疗方案和预后评估指标具有重要意义。低氧环境是恶性肿瘤增殖过程中的一个典型特点〔6〕。恶性肿瘤细胞增殖速率要快于肿瘤新生血管生成的速率，因此位于肿瘤组织中心位置，距离肿瘤微血管较远的癌细胞长期处于低氧状态，上述癌细胞通过自身的适应能力，重新塑造肿瘤微环境，具备了更强的生长、转移和放化疗抵抗能力〔7〕。相关研究显示，肿瘤细胞外泌体具有免疫抑制，诱发肿瘤增殖、转移、侵袭及耐药性产生的作用〔8〕。亦有研究显示，来源于上皮间质的非小细胞肺癌肿瘤细胞的外泌体能够诱发对化疗药物的抵抗〔9〕；来源于黑色素瘤细胞的外泌体能够通过自分泌和旁分泌信号通路来增加黑色素瘤细胞的转移风险〔10〕；来源于乳腺癌的外泌体能够通过IL-6/GP130/Stat3信号通路来影响巨噬细胞极化〔11〕。但针对于原发性肝癌发生、发展过程中低氧环境和外泌体的研究仍十分少见。

本研究使用差速离心法和超速离心法，分离提取低氧环境下HHCC细胞外泌体。通过电子显微镜观察和外泌体特异性蛋白Western印迹检测证实低氧环境下HHCC细胞外泌体提取成功。进一步将低氧环境下HHCC细胞外泌体与HHCC细胞共培养后检测显示，HHCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力均明显高于单独培养的HHCC细胞。提示低氧环境下HHCC细胞外泌体能够明显增强HHCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本次研究结果和以往研究报道均表明，作为细胞间信号传递载体的外泌体是肿瘤微环境中的重要组成成分；处于低氧环境中的肝癌细胞能够通过外泌体来增强常氧环境中肝癌细胞的增殖和侵袭能力。低氧环境中原发性肝癌细胞分泌的外泌体作为缺氧癌细胞和常氧癌细胞之间沟通的桥梁，介导了原发性肝癌肿瘤微环境中细胞恶性表型的传递。

综上所述，本研究证实了低氧环境下HHCC细胞外泌体能够促进常氧HHCC细胞的增殖、迁移和侵袭，阐释了外泌体在肝癌缺氧微环境中的重要作用。但未对相关分子机制进行深入探究，今后研究中可结合体内动物实验和长链非编码RNA测序，进一步探究缺氧外泌体对原发性肝癌细胞活性影响的分子机制。